文章信息
题目：SPATULA and ALCATRAZ confer female sterility and fruit cavity via mediating pistil development in cucumber
刊名：Plant Physiology
作者：Zhihua Cheng，Xiaolan Zhang et al.
单位：China Agricultural University
日期：07 April 2022
01
摘要
水果的种子在植物有性生殖和人类饮食中起着重要作用。成功的受精包括将花粉管中的精细胞沿着传输通道（TT）输送到子房内的卵细胞。果腔是直接影响黄瓜（Cucumis sativus）商业价值的不良性状。然而，在作物中，果腔的形成和生育力决定的调控基因仍然未知。在这里，我们描述了黄瓜中的一个基本螺旋环螺旋（bHLH）基因SPATULA（CSPT）及其与ALCATRAZ（CsALC）的冗余和发散功能。CsSPT转录物在生殖器官中富集。CsSPT突变导致黄瓜生育能力降低60%，种子仅在果实上部产生。由于心皮分离，Cspt-Csalc突变体表现出完全丧失生育能力和果腔。进一步的研究表明，双突变体的柱头向外翻转，柱头同一性有缺陷，异常TT中的细胞外基质含量显著减少，这导致花粉管无延伸路径，胚珠无受精。生化和转录组分析表明，CsSPT和CsALC在同二聚体和异二聚体中发挥作用，通过介导参与TT发育、生长素介导的信号传导和黄瓜细胞壁组织的基因，赋予果腔和雌性不育。
02
技术路线
Cucumber (Cucumis sativus L.) inbred line XTMC (North China type 'Xintaimici’)
Gene cloning and structural analysis
RT-qPCR
In situ hybridization
Subcellular localization
Cucumber transformation
Measurement of fruit physiological indexes
canning electron microscopy (SEM) observation
Pollen viability assays
In vivo pollen tube aniline blue staining
Alcian blue staining of transmitting tracts
Transcriptome analysis
Yeast two-hybrid assay
Bimolecular fluorescence complementation
Yeast one-hybrid assay
03
主要结果
3.1 黄瓜的生殖器官中富含CsSPT转录物
为了探索与黄瓜种子发生相关的基因，在CuGenDB数据库中搜索SPATULA的同源物（SPT:AT4G36930），因为SPT在拟南芥的育性维持中的作用。获得了具有最高相似度的Csa6G491000，并在下文中命名为CsSPT。CsSPT编码一个bHLH蛋白，具有八个外显子和七个内含子。RT-qPCR显示CSPT在生殖器官中高度表达，如雄性/雌性芽、雄蕊和子房。原位杂交表明，CsSPT转录物在发育中的花瓣、雄蕊和心皮原基中富集（图1，A-D）。在子房内部，CsSPT转录物在隔膜和胚珠原基中积累（图1，E）。亚细胞定位显示CSPT-GFP融合蛋白的荧光分布在细胞核中。
Fig. 1 A-E
3.2 Csspt-Csalc双突变体的果腔形成和雌性不育
考虑到SPT和ALC的推定的功能冗余，使用CRISPR-Cas9系统同时靶向CsSPT和CsA256640，并获得了5个T0独立的CsSPT-CsALC敲除植物。由于两个基因在不同染色体上的位置，分离出两个纯合Cspt单突变系。与野生型对照XTMC（WT）相比，Csspt和Csalc单突变体的果实显示出不分化的表型，而Csspt-Csalc双突变体果实似乎在上部较薄，内部有空腔（图1F）。在野生型果实中，心皮数量从3-5不等，所有心皮融合在一起形成完整的肉质果实。
有趣的是，Csspt-Csalc突变体果实的心皮彼此分离，导致内部形成明显的中空（图1，G）。然而，Csspt-Csalc水果中的主要代谢产物（可溶性糖/蛋白质/固体）和水含量与WT中的相当（图1，H-K）。
此外，在Csspt和Csspt-Csalc突变体中观察到生育缺陷。当Cspt突变体与野生型花粉自交或杂交时，每个果实收获的种子数分别为133.3±22.4和123.3±15.4，降至野生型自交（315.5±72.7）的40%左右（图1，L和N）。类似地，Csalc突变体显示雌株生育能力降低了95%（未发表的数据）。
在Cspt敲除的果实中，饱满的种子主要分布在子房顶端附近的上部，种子室的长度明显短于WT（图1，L）。在Csspt-Csalc双突变体中，当Csspt-Csalc用作母本时，雌性育性完全丧失，没有获得种子。同时，由于心皮分离，在果实内部沿纵向检测到明显的裂缝（图1，L和M）。然而，当Csspt或Csspt Csalc用作花粉供体使WT受精时，每颗果实的种子数与WT自花授粉相当（图1，L和N），这表明Csspt和Csalc在生育力中的作用是雌株特有的。
同样地，花粉活力染色和体外发芽试验表明，Cspt和Cspt-Csalc突变体的花粉形态不变，90%以上的花粉是活的（补充图S2 C-E）。这些数据表明，CsSPT和CsALC在调节黄瓜心皮融合和女性生育能力方面具有冗余功能。
Fig. 1
3.3 Cspt-Csalc突变体柱头和花柱的形态存在缺陷
为了剖析果实中空和雌性不育的假定原因，我们详细分析了雌蕊发育。与WT中的柱头会聚不同，Csspt和Csspt-Csalc突变体中的柱头向外卷曲，就像花冠开口一样（图2，A-D）。
SEM观察表明，在早期发育阶段，WT柱头裂片聚集在一起，而Cspt-Csalc柱头裂片彼此分离并向外转向平坦（图2，E-L）。开花时，当乳头状细胞可用于授粉时，Csspt或Csalc单突变体的柱头适度开放，而在Csspt-Csalc双突变体中，柱头完全开放，从而暴露内部结构（图2，M-P）。
此外，与WT相比，Cspt-Csalc柱头上乳头状细胞的大小显著减小。与WT中的球状细胞形状不同，Cspt Csalc的柱头乳头状细胞变得扁平和紧密，甚至形成气孔（图2，M’-P'），表明柱头有缺陷。
定量分析表明，Csspt、Csalc和Csspt-Csalc突变体的柱头宽深比分别为1.6±0.4、1.2±0.1和2.4±0.5，均显著大于WT（1.1±0.1）（图2Q）。Csspt、Csalc和Csspt-Csalc突变体的长宽比分别为2.0±0.4、1.4±0.2和1.6±0.4，也显著大于WT（1.2±0.2）（图2，R）。上述数据表明，在Cspt-Csalc双突变体中柱头和花柱形态严重破坏，在Csspt和Csalc单突变体中程度较低，表明这些突变体的顶端雌蕊同一性程度不同。
Fig. 2
3.4 Csspt和Csspt-Csalc突变体雌蕊花粉管延伸受阻
为了研究突变体中雌株缺陷的原因，首先，通过苯胺蓝染色对黄瓜WT雌蕊的花粉管延伸进行了时间过程观察。如补充图S3所示，授粉后2小时，花粉管伸出柱头并开始渗入花柱传递道（TT）。
5小时时，花粉管束穿过花柱并进入子房，但未到达1/4子房（子房指的是没有雌蕊柄的子房部分）（补充图S3 A）。10小时时，花粉管延伸超过1/4子房，但未到达1/2子房。横切面显示花粉管主要分布在TT内侧。在20小时时，花粉管束超出1/2子房，越来越多的花粉管出现在侧TT处，其中一些花粉管开始瞄准胚珠。25小时时，花粉管继续向下移动，在1/4和1/2子房的横向TT处花粉管密度进一步增加。在35小时时，花粉管在内侧、外侧和末端传递道处丰富。从25小时到35小时，很容易观察到花粉管进入胚珠的现象（补充图S3 B）。
接下来，比较WT和突变体雌蕊授粉后30小时花粉管在雌蕊内的延伸。纵向切片显示，与WT中的花粉管相比，在Csspt雌蕊中导航的花粉筒的密度显著降低（图3，A和B），而在WT中观察到的，Cspt雌蕊中的胚珠可以被花粉管瞄准（图3、A’和B’）。相反，Csalc-突变体的子房中的密集花粉管出现在侧TT，但没有沿着末端TT延伸到目标胚珠（未发表的数据）。
在Csspt-Csalc突变体中，花粉管聚集在雌蕊顶部，无法穿透柱头和花柱（图3，C和E）。横切面显示，与野生型相比，Cspt突变体柱头、花柱和卵巢的花粉管密度显著降低（图3，F-M）。在Cspt卵巢中展开的花粉管很容易像在WT中一样进入胚珠（图3，I’和M’）。一致地，在所有Csspt-Csalc雌性生殖道中都没有检测到花粉管，因此没有胚珠受精（图3，N-Q'）。
Fig. 3
3.5 Csspt和Csspt-Csalc突变体传递通道的结构变化
考虑到拟南芥中TT缺陷导致的spt突变体的育性降低，我们在WT和突变体雌蕊中通过Alcian蓝染色进行了TT结构观察。Cspt花粉管中细胞外基质（ECM）的含量显著低于WT，尤其是在中间区域，几乎不可见（图4，A-B’）。在Csspt-Csalc突变体中，除了缺少ECM外，还观察到TT结构和形态的明显变化（图4，C和C’）。
在子房中，Cspt突变体的TT与WT的TT相似，由2-3层不规则细胞组成，彼此紧密贴合，ECM含量略有降低（图4，D-E’）。而在Cspt-Csalc突变体中，TT由两层规则且均匀的细胞组成，ECM产量显著减少（图4，F和F'）。
为了探讨Cspt-Csalc突变体TT结构缺陷的发生阶段，在开花前8天（8 DBA）、4 DBA、2 DBA、AD（开花日）和3 DAA（开花后）的一系列时间点比较TT形态。从8 DBA到4 DBA，WT和Csspt-Csalc突变体之间的TT分化没有明显差异，这两个突变体都包含两层规则细胞（图4，G-J）。
从4 DBA到开花，在WT中，部分原始TT细胞扩增，产生了一些新的细胞，从而产生了具有致密细胞分布的致密传输道组织（图4，I，K和M）。而在Cspt-Csalc突变体中，TT细胞保持不变（图4，J，L和N）。
在3 DAA时，WT中的TT细胞似乎受到抑制和降解，而Csspt-Csalc突变体中的那些细胞仍然规则且清晰，难以区分（图4，O和P）。到那时，沿着TT的分裂变得可见，并在双突变体中产生果腔（图4，Q和R）。木质素染色显示，WT中TT细胞中存在分散的木质素，而在Csspt Csalc突变体中，木质素富集在两个细胞层的中间，导致心皮分离和空洞形成（图4，S和T）。
Fig. 4
3.6 Csspt和Csspt-Csalc传输通道中AGP的减少
据报道，阿拉伯半乳聚糖蛋白（AGPs）是TT细胞外基质的重要成分，在雌蕊花粉管延伸过程中发挥着关键作用。使用单克隆抗体JIM8和JIM13对WT和突变体中的AGP在开花时的花柱TT和子房TT上进行评估。与阴性对照（图5A和I）相比，TT中检测到JIM8和JIM13信号，Csspt和Csspt-Csalc突变体的荧光范围和强度远低于WT（图5，B-D和J-L）。这一结果解释了Cspt突变体穿透花柱和在卵巢内传播的花粉管数量急剧减少的原因。
在子房中，与阴性对照相比（图5，E-E“”），JIM8信号在TT和胚珠中明显富集，尤其是在胚囊和WT的外珠被内层（图5、F-F’）。在Csspt和Csspt-Csalc突变体中，TT中的JIM8信号明显较弱，更强的荧光分布仅限于胚珠珠被和胚囊（图5，G-H’）。类似地，与野生型相比，JIM13信号显示突变体中的TT显著减少（图5，M-P’）
Fig. 5
3.7 Cspt-Csalc突变体中柱头和TT发育相关基因表达减少
为了探索CsSPT和CsALC的推定下游基因，选择含有柱头和CsSPT、CsALC和CsSPT-CsALC突变体样式的顶端雌蕊进行转录组分析。与WT相比，Csspt中有63个上调基因和157个下调基因，Csalc-中有122个和149个，Csspt-Csalc中1327个和732个（FC>2，p<0.05）。
GO分析显示，Cspt-Csalc突变体中差异表达的基因（DEG）富含生长素激活的信号通路、细胞壁组织和防御反应（补充图S4，B）。热图显示，参与细胞壁组织的基因大多上调，参与生长素激活信号通路（AUX/IAA家族、生长素应答因子、膜转运蛋白和蛋白激酶结构域）的基因在Csspt-Csalc突变体中下调（图6，A）。据报道，Csa1G042820、Csa1G427480和Csa5G576590是黄瓜中生长素外排载体的同源物，分别命名为PIN-FORMED1a（CsPIN1a）、CsPIN2和CsPIN3。Cs1G537400是在黄瓜生长素运输中发挥作用的蛋白激酶PINOID。
WT和Csspt、Csspt-Csalc突变体柱头和子房上的RT-qPCR显示，所有这些生长素转运基因在Csspt-Csalc突变体的柱头中显著下调，但在卵巢中没有下调（补充图S4，C-D）。有趣的是，在TT发育中起作用的拟南芥NTT（AT3G57670）和BEE3（AT1G73830）的黄瓜同源物、Csa3G810580类CsANTT和CsA1G24150在Csspt-Csalc突变体中显著下调。
RT-qPCR证实了转录组结果，并显示Csspt-Csalc突变体的柱头和卵巢中的CsNTT样和CsBEE3表达显著低于WT（图6，B-E）。为了进一步探讨CsNTT样和CsBEE3与CsSPT和CsALC的关系，进行了酵母单杂交试验，然而，没有发现相互作用（补充图S5，A和B），这表明CsSPT与CsALC对CsNTT-样/CsBEE3的转录调节在黄瓜中是间接的。
Fig. 6
3.8 CsSPT、CsALC和CsWOX1之间的蛋白质相互作用
在拟南芥中，SPT和ALC相互形成蛋白质二聚体，以发挥其生物学作用。为了探讨CsSPT和CsALC之间存在的相互作用，进行了酵母双杂交试验。CsWOX1被用作蛋白质相互作用的候选基因，这是由于TTs与CsSPT和CsALC的表达模式重叠。CsALC和CsALC、CsSPT和CsARC、CsALC与CsWOX1之间存在强烈的相互作用，CsSPT与CsSPT、CsSPT与CsWOX1之间存在中等程度的相互作用（图7，A）。
接下来，进行了BiFC分析，并验证了CsSPT和CsSPT、CsSPT与CsALC、CsALC与CsAALC、CsARC与CsWOX1的相互作用，但CsSPT及CsWOX2的相互作用没有（图7，B）。这些数据表明，一种蛋白质伴侣CsWOX1与黄瓜中的CsSPT-CsALC模块相互作用。
Fig. 7
04
结论
我们的数据通过在黄瓜（一种重要的农业作物）中介导TT发育和心皮融合，确定了 CsSPT和CsALC在果腔形成中的作用（图8，C）。
在Cspt-Csalc双突变体中，生长素应答因子和生长素转运蛋白（CsPIN1a、CsPIN2、CsPPIN3、CsPID）显著减少（图6），这表明Csspt和Csalc通过积极介导黄瓜中的生长素通路调节柱头和花柱发育（图8，C）。
HAF/BEE1/BEE3的两个同源物中的一个在Csspt-Csalc 突变体中显著减少，这意味着两个TT发育基因在黄瓜中作用于Csspt和Csalc的下游，尽管调节可能是间接的（图6、图8和补充图S5）。
未来的研究需要剖析NTT和BEE3介导的黄瓜TT发育和雌株生育力测定的种具体机制。
Fig. 8
05
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原文链接：
https://academic.oup.com/plphys/article-abstract/189/3/1553/6564671?redirectedFrom=fulltext#
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