文章信息
题目：Pyruvate, phosphate dikinase regulatory protein impacts light response of C4 photosynthesis in Setaria viridis
刊名：Plant Physiology
作者：Chris J Chastain，Kuenzang Om et al.
单位：Minnesota State University-Moorhead
日期：25 July 2022
01
摘要
在C4植物中，丙酮酸（Pyr）磷酸二激酶调节蛋白（PDRP）以光/暗依赖的方式调节C4途径酶Pyr磷酸二激酶（PPDK）的活性。这种调节作用对C4途径功能和整体C4光合作用的重要性尚不清楚。为了解决这个问题，我们评估了C4植物狗尾草（Setaria viridis）的CRISPR–Cas9 PDRP敲除（KO）突变体体内PPDK磷酸调节和全叶光生理学。PDRP KO系叶片提取物中未检测到PDRP酶活性。同样，在PDRP调节Thr残基磷酸化的PPDK在叶提取物中免疫检测不到。快速叶提取物中的PPDK酶活性在PDRP KO系中组成性高，无论叶的光照或黑暗预处理如何。净CO2同化的气体交换分析表明，当叶片从暗到高光或从低光到高光转变时，PDRP KO叶片具有明显较慢的光诱导动力学。在最初的光诱导阶段的30 min，KO叶片与野生型（WT）相比，净CO2同化率降低15%。尽管诱导动力学较慢，但我们发现当在正常空气中和标准生长室条件下生长时，KO系的生长和活力与WT难以区分。然而，在波动光照条件下生长的PDRP KO植物表现出Fv/Fm的连续多日逐渐下降，这表明由于缺乏PDRP，光系统II发生了渐进性损伤。总之，我们的结果表明，PDRP在C4光合作用中的作用之一是在入射光的动态变化期间确保最佳的光合诱导动力学。
Fig. 1
02
技术路线
WT S. viridis (accession ME034v) was used for all experiments
CRISPR/Cas9 gene-editing, transgenic plant regeneration, and genotype analysis
In vitro PDRP protein kinase assays
Immunoblot detection of PPDK and phospho-PPDK in leaf extracts
PPDK enzyme assays
Gas exchange measurements
Leaf pyruvate content
Fluctuating light experiments
03
主要结果
3.1 PDRP敲除系在体外和体内缺乏PDRP活性
基于Cermák等人的植物基因组工程（2017）的CRISPR-Cas9系统基因编辑体系被用于敲除S.viridis基因组的单个PDRP基因（Sevir.2G348700）。使用该方案，通过潮霉素选择回收六株T0植物，每株代表一个独立的转化事件。PCR扩增的PDRP外显子1基因组DNA区域的桑格测序显示，每个T0系都是由CRISPR Cas 9引导RNA侧翼的相同68 bp缺失的纯合子（图2A，B）。三个T0 KO系，命名为T27、T28、T29，进行自交以产生分离的T1代植株。
随后，通过PCR筛查磷酸转移酶转基因（缺失）对这些基因进行基因分型，确认转基因（Cas9和潮霉素可选标记）已分离出来。将筛选的纯合T1 KO植物进行繁殖，最终产生T3代种子，用于产生本研究中使用的所有PDPR KO植物。
如图2B所示，CRISPR-Cas 9介导的68bp缺失修饰了外显子1的阅读框，从而在第一外显子的帧内终止密码子到达下游之前编码22个错义氨基酸。未测试来自该修饰位点的截短多肽的表达。然而，所有三个PDPR敲除系均显示缺乏PDRP酶活性（图2C），表明如果任何截短的PDRP累积，则其是无功能的。这是通过使用高度灵敏的体外基于免疫的PDRP蛋白激酶（PPDK磷酸化）测定建立的，在该测定中，我们没有检测到PDRP KO系的脱盐粗叶提取物中存在的任何残余PDRP活性（图2C）。如图所示，野生型叶提取物含有显著的PDRP活性，PPDK的ADP依赖性磷酸化证明了这一点。WT对照减ADP反应中的微弱条带（图2C，上图）表示少量内源性PPDK-ThrP通过体外反应中用作PDRP来源的10μL WT叶提取物引入测定。
Fig. 2
值得注意的是，PDRP敲除测定的负ADP控制通道中的这条微弱带缺失，这表明PDRP KO叶提取物中缺乏内源性PPDK-ThrP（以及PDRP活性缺失）。这一观察结果在用PPDK-ThrP抗体探测的从光照和暗适应的叶片中分离的叶片提取物的免疫印迹中更清晰地显示（图3）。
在本实验中，WT的叶片和两个PDRP敲除品系T27和T28首先暗适应4小时，然后在高辐照度下照射30分钟。对于野生型植物，我们发现在黑暗4小时后，内源性PPDK已高度磷酸化（图3 A和B上）。当WT叶片暴露于强光下30分钟时，暗适应叶片中存在的几乎所有PPDK-ThrP都被脱磷酸化为活性脱磷PPDK。相反，我们无法在来自两个PDRP敲除品系的叶片提取物中检测到任何PPDK-ThrP信号，无论对叶片进行暗处理还是光处理，再次证明PDRP敲除了植物中没有PDRP活性。当抗磷酸化PPDK探测的印迹被剥离并用抗PPDK抗体重新处理（用于检测总PPDK）时，PPDK带强度在WT和KO叶片之间似乎相等（图3A，B下），这表明PPDK水平不太可能受到PDRP损失的影响。
Fig. 3
最后，代表PDRP在敲除植物中缺失的第三条证据是叶片PPDK活性的体内光/暗调节的丧失（图4）。使用保持原位PPDK激活状态的快速提取和测定方法，我们表明暗适应PDRP敲除叶中的PPDK活性与光照叶中的基本相同。相反，暗适应WT叶片中的PPDK活性在很大程度上受到抑制。在暗适应WT叶片中剩余的约8%的PPDK活性可能代表源自胞浆PPDK亚型的PPDK活性，由于PDRP是质体定位的，因此其不受光/暗调节。值得注意的是，PDRP敲除叶片中的PPDK比活性在光照和暗照下都与光照WT叶片记录的高PPDK比活度相当。
Fig. 4
3.2 标准生长室条件下的生长表型
最初的PDRP敲除转化体和随后的T3代后代系被再生并保持在2%CO2中，以防止PDRP的丢失会损害生长和发育，从而危及PDRP敲脱植物的恢复。直到从高CO2生长的植物中收获纯合的T3种子，才评估正常空气中的发芽和生长。有趣的是，当在标准生长室条件下（正常空气条件，~700μmolm-2sec-1光照，16/8小时昼夜，31°C/22°C光周期）发芽和生长时，所有三个独立的PDRP敲除系在生长和活力方面与野生型植物在视觉上无法区分（图5）。
Fig. 5
3.3 辐照度水平对WT和PDRP敲除叶片PPDK激活状态的影响
如上所述，光照C4叶片中可提取PPDK活性的水平随着入射光强度的增加而成比例增加，达到约1/2阳光下的最大水平（约1000μmol m-2sec-1）。一般认为，PPDK活性的辐照度水平依赖性完全是由于PDRP的磷调节作用，而不是任何其他试剂。我们通过测量从低到高辐射下照射的T27和WT叶片中的可提取PPDK活性来检验这一假设（图6）。
在这里，PPDK活化状态由暗适应的3cm中间叶切片制备的快速叶提取物确定。对于WT叶片，PPDK激活状态（PPDK比活性）随着入射辐照度的增加而增加，直到达到600μmol量子m-2sec-1附近的最大水平。相反，T27叶片在所有辐照度水平和黑暗条件下的PPDK活化状态与WT叶片中PPDK的最高光激活状态相当。
Fig. 6
3.4 PDRP损失对叶片光合CO2同化和气体交换特性的影响
我们通过光照时间过程中叶片的气体交换分析，研究了PDRP损失对S.viridis叶片净CO2同化（Anet）的影响。具体来说，在记录数据之前，将植物从生长室中移出，并在黑暗中适应30分钟。在这个适应期之后，在120分钟的时间过程中，每分钟记录一次高光和低光的变化间隔。具体而言，首先记录Anet 30黑暗期，然后用强光（1500μmol量子m-2秒-1）照射30分钟，然后转变为弱光（100μmol量子m-1秒-1）30分钟。在最初的约10分钟光诱导阶段后，我们观察到T27叶片的Anet比率低于T27叶片。WT叶片（图7A），在30分钟高光照期结束时，Anet的比率比WT低约15%。然后，当叶片转变为较低的辐照度（100μmol量子m-2sec-1）时，WT和T27的Anet比率迅速下降，但WT叶片中的Anet仍高于T27叶片（图7B）。
Fig. 7
为了研究T27叶片的较低Anet持续时间是否超过30分钟，我们通过将初始高辐照度照射期延长至90分钟来重复该实验。如图8A所示，在进入照射期约30分钟时，T27叶片表现出与图7A相同的约15%的较低的Anet vs.WT。然而，随着光照时间超过30分钟，T27和WT的Anet在90分钟光照结束时逐渐收敛，这表明T27叶片中PDRP的损失大大延长了光合诱导阶段的持续时间（图8A）。为了了解T27叶片中较低的Anet是否可归因于气孔CO2扩散的限制，我们对气孔导度（gs）进行了相应的测量（图8B）。有趣的是，在光照期的15分钟左右，T27叶片中的gs较低，但在额外的20分钟光照后增加到WT水平（图8B）。在整个90分钟的光照期间，发现内部叶片CO2浓度（Ci）的相应测量值与WT相当（图8C）。因此，T27观察到的短暂较低的气孔导度（图8B）不太可能影响我们观察到的该基因型的Anet率（图8A）。
Fig. 8
为了确定图7A和8A所示T27叶片中PDRP的损失与Anet减少之间的任何联系，我们评估了类似高光照叶片（1300μmol量子m-2sec-1与1500μmol量子m-2sec-1，图7A）叶片提取物中的PPDK激活状态。这里，PPDK活化状态是从漂浮在dH2O上并从上方照射的3厘米中间叶切片制备的快速叶提取物中测定的。如图7B所示，在光照开始时，WT PPDK活性在约6分钟内从零快速增加到几乎完全光激活水平。相反，T27 KO叶片中的PPDK酶活性从暗适应叶片中的高初始活性到30分钟光照期结束保持不变（图7B）。当WT叶片转变到黑暗中时，PPDK的失活显示出比PPDK光激活慢，需要约30分钟的黑暗才能完全失活，这对于其他C4物种来说是典型的。当受照的T27叶片转变回黑暗时，PPDK激活状态（在进入黑暗期的10、20和30分钟时从WT叶片中交替采样）显示为保持较高且不变（图7B）。
3.5 全叶丙酮酸水平
由于发现PDRP KO叶片中的PPDK活性在黑暗中最高且恒定（图7B），我们推测叶肉基质中PPDK介导的PEP合成在黑暗中也具有活性。因此，我们认为，一旦叶片适应黑暗，Pyr的叶肉基质库可能会下降到异常低的水平，因为它会转化为PEP。为了检验这种可能性，我们评估了2小时黑暗适应期结束时和光照开始后3分钟的全叶Pyr水平。应该注意的是，虽然这些测量值代表了组合束鞘和叶肉绿质组织中的Pyr，但玉米的全叶测量值已显示出定性地反映了分离叶肉细胞中Pyr的暗/光变化。对于暗适应叶片，我们发现T27叶片中的Pyr水平约为WT叶片的40%（图9）。当这些暗适应的叶片暴露于强光下3分钟时，T27叶片中的Pyr显示出与暗水平相比保持相对不变，而在WT叶片中降低。
Fig. 9
3.6 恒定或波动光照条件下生长期间的全叶PS II效率
我们试图评估PDRP的损失如何在快速变化的入射光条件下影响C4叶片的光生理学，这是田间生长植物的典型情况（例如，云层或较低冠层叶片上的光斑对直接阳光的短暂干扰）。为此，我们通过脉冲幅度调制（PAM）叶绿素荧光（Fv/Fm）测量了在波动光照周期下生长的T27和WT植物与如前所述在稳定高光照或稳定低光照下生长的植物的PS II效率。
在本实验中，波动光照条件包括在16小时的光周期内，在1200μmol量子m-2 s-1下重复1分钟，在300μmol量子m-1下重复4分钟。稳定的光处理植物在每16h光周期850μmol量子m-2 s-1或90μmol量子m-1的恒定光照下生长。实验开始时，第0天的初始测量结果表明，WT和T27叶片中的Fv/Fm大致相同（约0.71，图10）。在波动条件下7天后，T27叶片中的Fv/Fm显著下降至第7天的0.37。对于WT波动光处理叶片，Fv/Fm在第3天下降至0.64，然后在第7天增加至0.68。在第7天结束于0.68的运行过程中，稳定强光处理的WT叶片的Fv/Fm基本上没有变化。因此，波动光处理的T27叶片的Ff/Fm从0.70急剧下降至0.37直接归因于PDRP的损失，因为没有观察到波动光处理WT叶片或稳定强光处理T27叶片中的类似下降。我们还在非常低的光照（90μmol量子m-2 s-1）下进行了额外的7天SL实验。在低稳定光照条件下，从第0天（~0.70）到第7天（~0.73），T27和WT的Fv/Fm值保持相对恒定，在每天的每个时间点，基因型之间的Fv/Fm值几乎相同（图10）。
Fig. 10
04
结论
我们发现，在稳定的光照条件下，PDRP的损失对S.viridis KO植物的生长和活力没有明显影响，这反映了这项研究。然而，与PpcK敲除突变体不同，我们能够证明C4叶片中PDRP的丢失如何转化为KO叶片中显著的生理变化（即，较慢的光诱导动力学、波动光中Fv/Fm的降低）和生化变化（即黑暗中较低的叶片Pyr水平）。因此，我们得出结论，PDRP比PpcK更严格地整合到C4途径调节中，并在确保较高的昼夜和季节净碳固定率方面具有潜在的更大的调节影响，表面上是针对受到动态光照的C4叶片。
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获取原文
原文链接：
https://academic.oup.com/plphys/article-abstract/190/2/1117/6649706?redirectedFrom=fulltext
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-130.html#_np=107_423
文末附件。
END
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