题目：An ethylene-responsive transcription factor and a B-box protein coordinate vegetative growth and photoperiodic flowering in chrysanthemum
刊名：Journal of Integrative Agriculture
作者：Jelli VENKATESH，Sung Jin KIM et al
单位：Seoul National University
日期：27 December 2022
01
摘要
西花蓟马（WFT；Frankliniella occidentalis）是一种以叶肉为食物的动物，会危害许多作物。由于繁殖力高、繁殖时间短、以多种寄主植物为食的能力以及广泛的抗药性等因素，WFT的管理非常复杂。这些挑战推动了开发WFT替代害虫控制方法的研究。
本研究分析了基于生物控制的策略的可行性，该策略利用RNA干扰（RNAi）介导的WTF内源性基因沉默来管理WFT。为了递送RNAi，我们开发了表达来自WFT的包被体蛋白亚基ε（CopE）和Toll样受体6（TLR6）的双链RNA（dsRNA）的转基因番茄系。这些基因参与WFT的关键生物学过程，其dsRNA经口摄入可对这些昆虫致命。与以野生型样本为食的昆虫相比，以表达转基因dsRNA的番茄花茎为食的成年WFT显示出更高的死亡率。此外，喂食TLR6和CopE转基因番茄RNAi系的WFT显示内源性CopE和TLR6转录物水平降低，这表明它们的死亡可能是由于RNAi介导的这些基因沉默所致。因此，我们的研究结果表明，表达TLR6和CopE双链RNA的转基因番茄植株可以对西花蓟马致命，这表明这些基因可能用于控制抗杀虫剂的WFT。
02
技术路线
从 WFT 中扩增出CopE和TLR6序列，并将其克隆到 pGEM-T 载体）中
农杆菌介导的番茄转化
转基因番茄植株的分子特征
从番茄植物中分离 RNA 和逆转录 (RT)-PCR
蓟马生物测定
WFT 中CopE和TRL6基因沉默的分析
Northern blot
03
主要结果
3.1 抗WFT转基因番茄植株的开发和选择
我们开发了两个pANDA反向重复序列（IR）构建体，分别编码与CopE和TLR6 WFT基因496和498bp片段相对应的dsRNA。反转重复序列由玉米泛素（Ubi）启动子和内含子驱动，以实现高水平的dsRNA表达（图1-A）。我们使用农杆菌介导的遗传转化将CopE和TLR6 IR构建体引入番茄中。
分别使用9个和7个假定的转基因CopE和TLR6 RNAi系进行进一步的分子表征。使用GUS接头和CopE和TLR6基因特异性引物通过基因组DNA PCR证实了转基因整合。九个CopE和所有七个TLR6 RNAi转基因番茄系中的八个含有转基因（图1-B和C）。GUS接头PCR阳性植物显示琼脂糖凝胶上存在636bp的条带。与此结果一致，所有GUS接头阳性植物也显示出分别对应于CopE和TLR6基因的496和498 bp带的存在（图1-B和C）。这些结果表明存在转基因整合到基因组中以及CopE和TLR6基因特异性转录物的合成。
3.2 转基因番茄植物中CopE-和TLR6特异性siRNA的积累
920bp的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因接头有助于dsRNA转基因系中dsRNA合成的可视化。因此，为了评估所选系中的转基因表达，我们使用GUS接头特异性引物进行了RT-PCR。基于RT-PCR分析，为每个基因构建体（CopE和TLR6）选择具有最高GUS接头表达水平的三个T1转基因植物进行Northern blot分析（图2-A）。使用生物素标记的DNA探针，我们在转基因系CP3、CP5、TL5和TL7中检测到21–23个nt siRNA杂交信号，表明CopE和TLR6 dsRNA的表达（图2-B）。在野生型植物中没有观察到杂交信号。
如RT-PCR分析所揭示的，表现出CopE和TLR6最高表达的T1植物自受精产生T2代。通过GUS接头PCR分析T2植物的叶片进行转基因分离。基于T2子代中的转基因分离，选择纯合转基因植物并自花授粉以获得T3种子用于进一步研究。这些转基因植株与野生型番茄植株相比没有表现出明显的表型差异。
3.3 转基因CopE和TLR6番茄植株对WFT的抗性增强
为了确定表达dsRNA的转基因番茄系是否会导致WFT死亡，我们在切花茎上进行了WFT饲喂生物测定（图3-A）。我们用WFT感染T2/T3 CopE和TLR6 RNAi植物，并监测成年WFT死亡率。在我们的初始生物测定中，我们使用了表达CopE（CP3系）和TLR6（TL5系）dsRNA的单个T2系以及野生型植物。与WT（36.4%的死亡率）相比，饲喂CP3（72.7%）和TL5转基因系（54.5%）的WFT在饲喂后72小时记录到显著较高的死亡率（图3-B），尽管CP3植物显示出比TL5植物更高的WFT死亡率。在T3生物测定分析中，使用了CopE的两个转基因系（系CP3和CP5）和TLR6（系TL5和TL7）（图3-C）。与T2生物测定相似，CopE（CP3和CP5）和TLR6（TL5和TL7）转基因番茄植株均导致WFT死亡率增加。与表达TLR6的植物相比，CopE转基因植物的WFT死亡率更高。当WFT饲喂CopE转基因番茄时，T2和T3植株在处理后72小时的死亡率分别为72.7%和78.100%。对于TRL6转基因番茄，在处理后72小时，T2和T3植物的WFT死亡率分别为54.5%和77-99%（图3-B和C）。从饲喂后60小时起，CopE和TLR6系的WFT死亡率显著高于WT番茄植株。喂食72小时后，CopE和TLR6 T2系上存活的WFT少于50%，而WT上的存活率约为70%（图3-D）。在饲喂T3转基因系的WTF中观察到WTF存活率降低的类似趋势（图3-E）。在喂食后72小时，超过90%的WTF死亡，而WT的存活率为90%（图3-E）。总之，在表达CopE和TLR6 dsRNA的T2和T3转基因番茄植株中，WFT抗性增加的类似趋势证实了CopE和TLC6转基因的稳定遗传。这些结果表明，由于CopE和TLR6基因的RNAi介导沉默，与野生型植物相比，转基因植物上的WFT存活率显著降低。
为了确定饲喂WFT dsRNA产生转基因番茄植株的效果，我们对WFT中的CopE和TRL6进行了qPCR分析。与WFT饲喂的野生型番茄相比，WFT饲喂转基因番茄中CopE的相对表达显著降低，而TRL6的表达略有降低（CopE和TRL6转基因番茄的P分别为0.03707和0.3165）（图4-A和B）。因此，这些结果表明WFT摄入dsRNA并成功地沉默了内源性基因。
04
结论
这些结果与先前的研究一致，在先前的研究中，当昆虫取食浸泡在CopE和TLR6 dsRNA溶液中的叶盘时，WFT生长受到抑制（Han等人，2019）。此外，包括COPI和COPβ在内的外壳蛋白复合物成分的dsRNA已被证明对科罗拉多马铃薯甲虫和植食性螨有效。我们的结果表明，与昆虫特异性必需基因CopE和TLR6相对应的dsRNA的转基因表达可以增强番茄对WFT的抗性，并可能被用作保护植物免受虫害的策略。
在这项研究中，我们使用农杆菌介导的转化来开发稳定的转基因番茄植物，表达两种基本昆虫基因CopE和TLR6的dsRNA。我们的结果表明，当喂食产生dsRNA的转基因植物时，CopE和TLR6 dsRNA的基因表达可以诱导WFT中相应内源基因的RNAi。与野生型植物相比，内源性CopE和TLR6的RNAi沉默加速了WFT的死亡率。在两种RNAi植物之间，与TLR6 dsRNA植物相比，CopE dsRNA植物表现出略微更大的WFT抗性。
我们的研究结果表明，基因工程的CopE/TLR6 dsRNA系可能有助于在温室和大田作物中管理WFT，这种方法可能导致新的虫害抗性应用。应进行进一步研究，以验证其在田间条件下的有效性，并测试两个或更多致命基因的同时RNAi沉默是否会赋予更大的害虫抗性。考虑到CopE和TLR6在昆虫生物学中的重要作用，需要更多的研究来确定CopE/TLR6对害虫管理中重要的其他生物参数的RNAi沉默作用，如若虫发育、雌性繁殖力和WFT的成年寿命。
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原文获取
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2095311922002945?via%3Dihub
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-148.html
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