题目：Disruption of the amino acid transporter CsAAP2 inhibits auxin-mediated root development in cucumber
刊名：New Phytologist
作者：Xuehui Yao, Xiaolei Sui et al.
单位：China Agricultural University, Beijing
日期：02 May 2023
01
摘要
氨基酸转运蛋白是植物内有机氮分布的主要介质，对植物生长发育至关重要。尽管具有这一重要性，但在黄瓜 ( Cucumis sativus )中探索和阐明的氨基酸转运蛋白基因相对较少。
在这里，在黄瓜基因组中鉴定出总共 86 个氨基酸转运蛋白基因。我们进一步确定了在不同组织中表现出不同表达模式的氨基酸通透酶 (AAP) 亚家族成员。
我们发现CsAAP2作为编码功能性氨基酸转运蛋白的候选基因在黄瓜根维管细胞中高表达。CsAAP2基因敲除品系表现出根分生组织发育停滞，从而导致侧根的延迟启动和根伸长的抑制。更重要的是，由于黄瓜根系发育缺陷，aap2突变体的芽生长严重受阻。
此外，aap2突变体在根中表现出更高浓度的氨基酸和木质素。我们发现突变根具有更强的酸化培养基的能力。此外，在aap2突变体中，极性生长素运输在根尖被破坏，导致根中的生长素水平升高。有趣的是，弱碱性培养基通过刺激生长素途径挽救了它们严重减少的根系生长。
02
技术路线
Wild-type (WT) cucumber (Cucumis sativus L. cv 'Xintaimici’) and mutant lines were grown in a glasshouse under natural light
Identification of amino acid transporter genes in cucumber
Amino acid analyses、Heterologous expression of CsAAPs in yeast、RNA expression analysis
Uptake studies with 15N-Ala and 15N-NO3−
Determination of nitrate reductase activity
Histochemical localization of GUS activity
Immunostaining of GUS and IAA
Subcellular localization of CsAAP2
03
主要结果
3.1 黄瓜氨基酸转运蛋白的鉴定与分类
在黄瓜中，分析了不同器官中单个游离氨基酸的组成和浓度。总的来说，黄瓜不同部位的氨基酸浓度存在显著差异。特别是在所有器官中，尤其是茎中，都发现了高水平的谷氨酰胺（Gln）。此外，茎中丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）的浓度也较高。此外，我们发现大多数游离氨基酸的含量随着果实在开花后0至9天（DAA）的发育而增加，即市场成熟期（图S1）。
在植物中，氨基酸转运通常由转运蛋白介导。在我们的研究中，在黄瓜中总共鉴定了86个氨基酸转运蛋白基因。总氨基酸转运蛋白（AAT）直接分为三个主要组AAAP、APC和UMAMIT家族，它们可以分别进一步分为不同的亚家族（图S2）。此外，蛋白质序列的基序分析（图S3）与系统发育分类一致，表明AAAP、APC和UMAMIT家族中转运蛋白的结构和生物功能分别相似。CsAAP的比对表明，AAP亚家族中的大多数基序和跨膜（TM）区域是保守的（图S3a，S4）。
3.2 CsAAP在酵母中的异源表达及其特性研究
互补分析表明，CsAAP可以介导酵母在酸性和中性氨基酸上的生长（图第1a段）。此外，我们观察到，在天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、谷氨酰胺（Gln）、天冬酰胺（Asn）和γ-氨基丁酸（GABA）分别作为唯一氮源的培养基上，表达CsAP2和CsAP6的酵母细胞表现出比表达CsAP3、CsAP5和CsAP4的细胞更好的生长（图第1a段）。这些结果表明，黄瓜CsAAP编码具有广谱氨基酸和不同底物特异性的功能性转运蛋白。
为了进一步支持这些互补数据，分析了在以Ala为唯一氮源的培养基上表达CsAAP的酵母细胞的生长速率（图1b）。结果显示，与具有空载体的酵母相比，具有CsAAP6/pYES2的22个Δ10α转化体的生长速度最快，而表达CsAAP4的酵母对Ala的亲和力低得多（图1b）。表达CsAAP的22Δ10α菌株对15N-Ala摄取的动力学特异性分析显示，15N-Alan的Km值范围为43.12至137.60μM（图1c–g）。在分析的CsAAP中，CsAP4对15N-Ala的亲和力最低（图1e），这与酵母生长互补分析一致（图第1a段）。这些发现证实了这五种CsAAP对Ala摄取具有不同的亲和力。
3.3 CsAAP2在黄瓜根中高度表达
在我们之前的研究中，CsAAP3主要表达于果实维管束的内部韧皮部，而CsAAP6最有可能参与叶柄外部韧皮部的氨基酸运输，已使用转录组数据进行了鉴定。为了检测黄瓜CsAAP的组织特异性表达，在各种器官中进行了绝对qRT-PCR（图2a）。表达谱显示，与其他组织相比，除CsAP5外，所有五个CsAAP基因在根中的mRNA丰度通常较高，尤其是CsAP2处于最高水平时（图2a）。重要的是，CsAAP2在黄瓜根中的表达随着幼苗的生长期而增加。
为了更详细地分析CsAP2的表达模式，我们使用毛状根转化系统在黄瓜中转化了PCsAP2：：GUS载体。组织化学分析表明，CsAAP2启动子在初生根和侧根的脉管系统中具有活性（图2b–e），特别是在成熟区（图2c）、伸长（图2d）和细胞分裂（图2e）。对根横截面的分析表明，GUS活性分散在整个中柱，包括年轻主根和侧根的中柱和脉管系统（图2f–g0）。
通过使用抗GUS抗体的免疫染色来研究CsAAP2的精确细胞定位。与GUS染色结果一致，在根脉管系统的中柱鞘、韧皮部和实质细胞中检测到GUS活性（图2h，h0）。
此外，在烟草叶片表皮细胞中，GFPCsAAP2融合蛋白瞬时表达产生的绿色荧光与作为质膜标记的CsSWEET7a-mCherry融合构建物传递的红色荧光重叠（PM；图2i–m），证明CsAAP2是质膜定位蛋白。因此，基于上述发现，我们推测CsAP2是否在黄瓜根中氨基酸的吸收和运输中发挥关键作用。
3.4 敲除CsAAP2导致根系生长抑制
为了研究CsAAP2在黄瓜发育中的功能，我们通过CRISPR/Cas9基因编辑技术产生了三个独立的CsAAP2突变体（图S7）。选择了两个突变体aap2-1#和aap2-2#，它们在所需的靶位点分别具有72bp和90bp的缺失（图第3a、S7段）。随着黄瓜幼苗的发育（图3b–e），aap2突变体在交配后6天和10天表现出缩短的根和更少的侧根（DAG；图3f，g），以及在两个真叶期（25 DAG）显著减少的总根长；图3小时），与WT相比。此外，与WT相比，两个aap2突变体的根和地上部的生物量都显著降低（图3i）。为了进一步评估CsAAP2对黄瓜植株生长的影响，通过激光扫描共聚焦显微镜观察了早期根系发育特征（图第3j–n段）。结果表明，突变体主根尖分生组织的细胞分裂似乎被延迟，表现为静止中心（QC）、皮层/内胚层首字母缩写（CEI）和小柱干细胞的频率相对于WT植物显著降低（图3j，k）。此外，我们发现，与野生型相比，aap2突变体显示出侧根原基（距离主根尖1cm以内）的启动较慢（图3l），伴随着侧根尖分生组织的分化停滞（图3m，n），与主根尖的情况一样（图3j，k）。这些结果表明，CsAAP2可能参与黄瓜的发育，尤其是根系的发育。
3.5 CsAAP2突变改变黄瓜根中游离氨基酸的浓度
为了进一步证实CsAAP2突变对氨基酸转运的影响，我们分析了黄瓜根中总游离氨基酸的浓度。令人惊讶的是，我们发现aap2系根中游离氨基酸的水平显著高于野生型（图4a）。具体而言，我们进行了短期和长期的15N摄取实验，以检测CsAP2对暴露于0.2mM 15N-Ala的植物的根氨基酸易位的贡献（图4b）和2mM 15N-NO3-（图4c）分别作为唯一的N。10分钟后，在根中检测到15N标记，并且与WT相比，在aap2中没有发现15N量的差异（图第4b、c段）。
此外，随着时间延长至180分钟，与野生型相比，用15N-Ala处理的aap2根部的15N水平显著增加（图4b），而aap2根部15N-NO3−衍生物的水平低于野生型（图4c）。同时，aap2突变体芽中15N丰度的降低可能是由于来自根的N易位减少（图S8）。值得注意的是，硝酸还原酶基因（CsNR）的表达水平降低（图4d），而突变体根中的NR活性增加（图4e）。这表明NR可能在转录和转录后水平上受到高度调节。
另一方面，研究结果可能表明突变根中氨基酸的积累会影响硝酸盐的同化。在初级氮同化过程中，无机氮（如硝酸盐或铵）在植物中转化为Gln和Glu。对水稻的研究表明，暴露于单个Gln和Glu作为单一氮源的植物表现出降低的生长表型。
接下来，我们使用水培培养来检测Gln和Glu作为唯一的氮源对黄瓜幼苗生长的影响。结果显示，在5μM或更高的浓度下，WT和aap2根对Gln或Glu的生长逐渐受到抑制，但在突变植物中发现了更明显的抑制作用（图4f–i）。
事实上，在5μM Glu下，与WT相比，aap2突变体的根伸长显著降低（图4g，i）。这些结果表明，aap2根对外源Gln和Glu更敏感，这可能导致突变体和WT之间的根生长差异。为了进一步证实CsAAP2突变对根生长和根中氨基酸积累的影响，我们在波动的N（NO3−）条件下水培黄瓜。20天后，与正常N条件相比，WT和aap2突变体在½N营养液中生长时，根长或根重都明显增加（图4j–l），水培aap2幼苗根中的游离氨基酸量显著减少（图4m）。然而，与正常氮条件相比，在2N条件下生长的aap2植物在根长和根重方面表现出更明显的下降趋势（图4j–l），表明高氮水平对aap2突变体根生长的抑制很可能是由于根中游离氨基酸的过度积累（图4m）。
3.6 CsAP2对黄瓜地上部生长发育至关重要
考虑到植物的地上和地下部分紧密相连，我们比较了野生型和aap2突变体植物在田间条件下的枝条生长（图5）。显然，在两个aap2品系中，测得株高、根干重、叶数和面积以及果实长度和重量显著下降（图第5a–j段）。与先前对游离氨基酸的分析一致，在aap2品系的根中，大多数酸性和中性氨基酸的水平（图5k）和总游离氨基酸的水平显著增加（图5m）。
此外，在aap2突变体中，可能是由于根系较小，以及氨基酸在根部的积累，较少的氨基酸被转移到木质部导管，导致突变体木质部汁液中的氨基酸含量降低（图第5l段）。因此，与野生型相比，aap2叶片和果实中的总游离氨基酸含量显著较低（图5m），以及总氮含量（图5n）。这些结果表明，CsAP2可能通过黄瓜中一个复杂的未定义网络介导氨基酸在根和地上部以及源和汇之间的运输和分布。
3.7 aap2植物的根分生组织发育停滞可能涉及生长素在根尖的过度积累
接下来，我们讨论了氨基酸过度积累如何影响黄瓜aap2突变体的根系发育。首先，主要基于先前报道的方法分析了WT和突变体幼苗根中质外体游离氨基酸的水平。由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）主要存在于细胞质中，因此分别检测了质外体和同质树液中G6PD的酶活性，以确定质外体成分污染的程度（图6a）。
在我们的研究中，在同胚树液提取物中观察到极强的G6PD活性；相比之下，在质外体组分中几乎检测不到其活性（图6a），这表明估计质外体空间中游离氨基酸含量的提取方法是可行的。值得注意的是，我们的数据进一步表明，aap2根中的质外体游离氨基酸含量显著高于WT（图6b），这表明根质外体空间中氨基酸再分配的改变可能会影响黄瓜根的生长。那么，游离氨基酸在根系细胞外空间过度积累会产生什么后果呢？据报道，AAP是一个原偶联氨基酸转运蛋白家族，利用H+的电化学梯度来驱动氨基酸的转运。
接下来，我们通过将幼苗转移到补充有pH指示剂的培养基上来观察根际酸化。有趣的是，在短短几个小时内，aap2突变体的水培根显著酸化了培养基（图6c），表明突变体根中质外体氨基酸的分布紊乱可能会影响H+的流动。考虑到植物激素生长素在根发育和根分生组织维持中起着至关重要的作用，我们接下来通过使用吲哚乙酸抗体的免疫组织学研究测量了黄瓜根尖中的吲哚-3-乙酸（IAA）水平。我们发现，aap2根尖的游离IAA水平显著高于WT（图6d）。
对表达生长素反应标记DR5:：GUS的幼苗的分析进一步表明，明显过量的生长素在aap2突变体的初级根尖中积累，特别是在根尖分生组织和脉管系统（stele）组织以及延伸区内（图6e）。与aap2突变体根尖中生长素水平增加的发现一致，我们观察到生长素生物合成基因（CsYUC2、CsYUC4和CsYUC10；图6f）和生长素外排载体PIN家族蛋白基因（除CsPIN2外，CsPIN1、CsPIN3、CsPIN 4和CsPIN7；图6g）的转录水平在aap2突变体中均显著上调，而生长素流入载体AUX1的mRNA丰度在aap2突变体中与野生型植物相比没有明显变化（图6h）。
此外，我们研究了CsPIN2和CsPIN4在WT和aap2突变体根中的表达，使用它们各自的启动子与报告基因GUS融合（图6i，j）。因此，在突变体植物中，与WT相比，在根尖中观察到更强的CsPIN4信号，特别是在分生组织和中柱组织中（图6i）。然而，在aap2突变体和WT之间，CsPIN2在中柱和根尖横向相邻延伸区的表达没有显著差异（图6j）。这与qRT-PCR结果一致（图6g）。因此，我们推测，aap2突变体对根系生长的抑制很可能是由于突变体和野生型之间根尖内局部生长素分布的显著差异（图6k）。总之，结果表明，aap2根中较高浓度的质外体游离氨基酸可能导致H+富集，从而干扰生长素的运输和分布，从而导致突变体的根生长缓慢。
3.8 aap2根中的高生长素状态与质外体酸化有关
由于培养基pH条件可以显著诱导根组织中的质外体pH变化，我们通过改变培养基的pH来研究质外体酸化水平、生长素积累和根生长之间的因果关系（图7）。WT和aap2突变体在具有不同培养基pH（分别为pH 5.8、pH 7.5和pH 4.5）的水培培养基中生长10 DAG（图7a–e）。值得注意的是，在微碱性条件下（pH 7.5；图7a–c），aap2根的生长在一定程度上得到了促进，这表明微碱性可能抵消了酸的抑制作用，从而挽救了aap2幼苗的根生长。
为了研究微碱性是否通过生长素途径恢复aap2突变体的根系生长，我们检测了生长素相关基因的表达（图7d，e）。因此，在微碱性条件下（pH 7.5；图7d，e），aap2突变体中CsYUC4和CsPIN4的转录水平显著降低。这一结果表明，在微碱性条件下，生长素在突变体根中的过量积累可能已经大大减少，这一点通过检测初级根尖中的DR5:：GUS活性得到了进一步证实（图7f）或侧根原基。相比之下，WT和aap2突变体，尤其是WT，在恒定的酸性环境中（pH 4.5；图7a–c），根系生长受到严重抑制。同时，在酸性条件下（pH 4.5；图7d–f，S9），CsYUC4和CsPIN4的表达以及生长素反应标记DR5:：GUS的活性在WT的根中显著上调。
为了进一步研究培养基pH对根系生长的生理影响，我们在基础营养液（pH 5.8）中培养10天，然后将它们转移到不同pH的培养基中再培养10天（图7g，h）。引人注目且相似的是，10天后，随着培养基pH值从5.8增加到7.5，aap2突变体植物表现出更大的尺寸和更高的根干重，而酸性培养基（pH 5.8–4.5）显著降低了野生型植物的根尺寸和根干重（图7g，h），进一步表明微碱性条件有助于恢复aap2突变体被抑制的根生长，而日益酸性的环境严重阻碍了WT幼苗的正常根系生长。
总之，我们的研究结果表明，细胞外H+滞留可能是由质外体游离氨基酸的过度积累诱导的，最有可能通过调节aap2突变体中的生长素活性来延缓黄瓜根系的发育（图6，7）。
3.9 CsAAP2的敲除导致根尖的早期木质化
为了进一步探索aap2突变体和WT幼苗之间黄瓜根生长差异的原因，对发育早期（10 DAG阶段）的主根进行了RNA测序（RNA-Seq）。与野生型植物相比，360个基因在突变体中差异表达，其中272个上调，88个下调（图8a）。进一步的KEGG分析表明，大多数上调的差异表达基因（DEG）参与次级代谢产物的生物合成途径，如前三类，如“苯丙烷生物合成”、“糖酵解/糖异生”和“α-亚麻酸代谢”（图8b）。相应地，在上调的DEG中，aap2突变体中苯丙素生物合成相关基因的表达丰度明显增加（图8c）。值得注意的是，在与N转运和转化相关的上调的DEG中，包括硝酸盐转运蛋白（NRT1家族）和UMAMIT的氨基酸转运蛋白（两个WALLS ARE THIN 1（WHT1）基因，与拟南芥WAT1同源（图8c）。
鉴于苯丙烷代谢途径与木质素的合成密切相关，我们发现与WT相比，几乎所有木质素生物合成途径的基因在aap2突变体中都显著上调（图8d），导致aap2植物中木质素的积累程度显著增加（图8e）。同时，类似地，初级根尖的间苯三酚染色结果表明，与WT相比，两个突变体系中木质素的染色强度明显更强（图第8f段）。这些结果表明，CsAAP2基因的敲除可能导致黄瓜根细胞在成熟前的早期木质化。
04
结论
尽管在拟南芥、水稻和其他植物中氨基酸转运蛋白的鉴定和功能表征方面取得了相对广泛的进展，但在黄瓜中很少有转运蛋白得到功能表征。在之前的工作中，我们报告了CsAAP3和CsAAP6的鉴定，它们分别与水果和叶柄的脉管系统中的氨基酸运输有关。
在本研究中，发现CsAAP2在黄瓜中柱鞘细胞中高度表达，并与根系发育密切相关。具体而言，敲除CsAAP2可能导致根分生组织发育停滞、侧根启动延迟、根伸长受到抑制，以及木质素在早期发育时在根中过度积累。我们发现，黄瓜aap2突变体根中胞外氨基酸的积累可能会影响质外空间的pH值以及生长素在根中的合成和分布。总的来说，我们的研究结果为氨基酸转运蛋白在黄瓜根系发育中的作用提供了见解。
总之，我们的研究表明，CsAP2可以作为一种氨基酸转运蛋白，负责黄瓜根中氨基酸的适当分配。CsAP2基因功能的丧失可能间接导致生长素积累和根细胞的早期木质化，从而抑制黄瓜的根系发育和地上部生长。
05
原文获取
原文链接：
https://nph.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/nph.18947
原文获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-199.html
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