题目：A point mutation in the gene encoding Mg-chelatase subunit I influences strawberry leaf color and metabolism
刊名：Plant Physiology
作者：Yang-Yang Ma, Jia-Yue Feng et al.
单位：Northwest A&F University, Yangling
日期：22 April 2023
01
摘要
镁螯合酶催化镁插入原卟啉 IX，是叶绿素生物发生的重要步骤。该酶由三个亚基组成，（镁螯合酶 I 亚基，CHLI）、（镁螯合酶 D 亚基，CHLD）和（镁螯合酶 H 亚基，CHLH）。CHLI 亚基是一种介导催化作用的 ATP 酶。以往对 CHLI 的研究主要集中在模式植物物种上，其在其他物种中的功能尚未得到很好的描述，尤其是在叶片着色和代谢方面。
在这项研究中，我们鉴定并表征了草莓品种Fragaria pentaphylla中的 CHLI 突变体。该突变体称为p240，其叶子呈黄绿色，叶绿素 (Chl) 水平较低。
RNA-seq 在第 186位中发现了一个突变CHLI 亚基的氨基酸，这是大多数光合生物中保守的碱基。将野生型 CHLI 瞬时转化p240补充了突变表型。
由 RNA 干扰 (RNAi) 和 CRISPR/Cas9 基因编辑产生的更多突变体包含了所有突变体表型。值得注意的是，杂合子chli与强光条件相比，突变体在弱光条件下积累了更多的叶绿素。在高光条件下对无效突变体的代谢物分析揭示了氮和碳代谢的显着变化。
进一步分析表明，CHLI 的 Glu186 突变不影响其亚细胞定位，也不影响 CHLI 与 CHLD 之间的相互作用。然而，分子内相互作用受损，导致 ATP 酶和镁螯合酶活性降低。这些发现表明 Glu 186在酶功能中起着关键作用，通过六聚体环本身的形成影响叶片着色，并且 CHLI 的操作可能是提高草莓植物在弱光条件下的适应性和光合效率的一种手段。
02
技术路线
pink-fruited quinquefoliolate strawberry (Fragaria pentaphylla) accession Pao’er and red-fruited woodland strawberry (Fragaria vesca)
Pigments, Chl precursor and enzyme activity analysis
Transmission electron microscopy
Protoplast isolation and chloroplast calculation
RNA-seq analysis、
Plasmid construction
Strawberry transient transformation、Strawberry stable transformation、Detection of transgenic-plant
Subcellular Localization assay、Yeast Two-Hybrid Assays、BiFC、Metabolome analysis
03
主要结果
3.1 草莓p240突变体Chl水平降低，叶绿体发育受损
利用ENU诱变筛选，从M1群体中分离到p240突变体。如图1a所示，p240与其亲本系相似，具有许多匍匐茎和大量子代植株。当在生长室(图1a)或温室(图1b)中种植时，与野生型植物相比，p240突变植株总是表现出稳定的黄绿色叶片表型。叶绿素定量显示，Chl a和Chl b的积累量不到野生型(WT)的三分之一，类胡萝卜素(Car)含量约为野生型(WT)的一半(图1c和1d)。
接下来，为了探究黄绿色表型是否与叶绿体数量和/或发育有关，我们提取并分析了p240突变型和野生型植物的原生质体。p240突变体与野生型的叶绿体数量无显著差异(图S1)。透射电镜(TEM)分析了突变型和野生型背景之间的发育差异。与野生型相比，突变体叶绿体中既没有明显的片状膜，也没有颗粒状结构，而是普遍存在质体舌状物(图1e)。这些结果表明，该突变抑制了色素的生物合成和叶绿体的发育。
3.2 p240表型候选基因的分离与鉴定
p240在温室和生长室内均不能诱导开花，因此不能产生M2植株。这一问题使得对p240表型相关基因进行正向遗传学定位变得困难。另一种策略是通过RNA-Seq分析来确定p240表型的候选致病基因。利用成熟叶片构建cDNA文库。每个文库获得了约4,000万份reads，并与Fragaria vesca参考基因组V4.0进行了比对。平均唯一映射效率为79.14%。确定了野生型和p240中的差异表达基因(DEGs)。共检测到4,557个转录本，其中2,333个转录本的丰度较高，2,224个转录本的丰度较低(图S2a)。
我们对这些DEGs进行了GO富集分析，并富集了“细胞成分”中匹配GO项的转录本(图S2b)。将差异表达基因与KEGG通路数据库进行比对。在4557个DEGs中，1357个(29.8%)被分配到114个KEGG通路。图S2c列出了19条最显著富集的通路(p值<0.5)。我们还利用picard-tools对对齐结果进行了染色体坐标排序，删除了重复读长，并确定了snp(图S2d)。KEGG富集分析发现与卟啉和叶绿素代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、硫代谢、淀粉和蔗糖代谢以及碳代谢相关。对NCBI数据库中与这些通路相关的所有基因进行RNA-Seq数据集中的snp分析，发现2个基因，atp依赖性磷酸果糖激酶4 (PFK4)和镁螯合酶ⅰ亚基(CHLI)含有突变。
从p240和野生型植物中克隆并测序这两个基因的编码序列。FpCHLI和FpPFK4的CDS分别发生了g1028a (E186K)突变和g3480t (A450S)杂合突变(图2a和S3)。为了测试这些突变是否是因果关系，我们产生了FvePFK和FveCHLI RNAi转基因植物。FvePFK4的转基因草莓表现出与野生型相似的绿叶表型，而FveCHLI的转基因植株表现出与p240相似的表型(图3)。
为了进一步分析FpCHLI，我们从五个八倍体栽培草莓Fragaria ananassa Duch品种和野生二倍体草莓Fragaria vesca品种夏威夷4和Ruegen中克隆了CHLI的CDS。我们对栽培或野生草莓的CHLI序列进行了比对，表明p240中的赖氨酸(Lys)与所有其他品种的谷氨酸(Glu)相比是独特的。这一结果表明Glu残基是高度保守的(图2b)。在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索拟南芥、葡萄、番茄茄、小苹果、水稻、synechococcus elongatus和球形红杆菌(Rhodobacter sphereroides)的相似序列。氨基酸序列比对显示，第186个氨基酸在所有这些物种中都是保守的(图S5)。
CHLI是构成mg -螯合酶的三个亚基之一，在叶绿素生物合成中催化生成Mg-ProtoIX 。进一步测试CHLI Glu186突变,CaMV35S:: CHLI-GFP构造注入p240树叶。提取注射后10 d的叶片进行western blot分析。检测到72 kDa的单一蛋白条带(GFP为~26 kDa, CHLI为~46 kDa)(图S6)。结果表明，经过10 d处理的258个叶片呈现出叶绿素扇区(图2e)。当一个匍匐茎表现出嵌合表型和叶绿体扇形时，观察到稳定转化和突变影响的证据。测序后，黄绿色的叶子显示出突变的CHLI(图2f)。
3.3 CHLI突变导致p240呈黄绿色表型
为了评估CHLI是否调控p240的黄绿色表型，我们构建了FveCHLI RNAi植物。采用农杆菌介导的叶盘转化法转移林地草莓。获得标记为chliRNAi的RNAi转基因植物，并在RNA水平进行验证(图3a和图3b)。所有的chliRNAi植物都表现出与稳定状态的mRNA水平相关的斑驳叶片表型。相对于WT，具有较低CHLI转录物积累的转基因植物具有较低的Chl水平(Chla和Chlb)(图3a)。通过透射电镜对叶绿体的超微结构研究表明，chliRNAi的叶绿体也异常(图3c)。
在野生型中，叶绿体发育正常，呈现紧密堆叠的类囊体。相反，chliRNAi显示叶绿体中没有基粒堆叠。此外，整个叶绿体中存在大量囊泡样结构。为了研究Mg-proto IX的产生是否受到影响，我们使用商业抗体检测了Proto IX和Mg-proto IX蛋白水平。结果显示，所有突变体的Proto IX水平与WT相似(图3d)。然而，chliRNAi-1#、chliRNAi-2#和chliRNAi-3#所含的Mg-Proto IX水平显著低于WT，而chliRNAi-4#与WT无显著差异(图3e)。
为了进一步测试CHLI是否导致p240的黄绿色表型，我们使用CRISPR/Cas9基因编辑技术在fvecli背景中产生了类似的突变。我们对草莓进行了碱基编辑和基因组编辑。不幸的是，我们未能从碱基编辑中获得阳性植物。对于基因组编辑，目标序列见图4a。我们通过荧光(图S7)和表型筛选了阳性T0植株。因此，共获得115株T0阳性植株，其中56株(48.7%)叶片颜色与WT相比有明显差异(图4b, c)。56株T0植株的表型分别为黄绿色、白色斑点、半绿半黄和白化。如果存在WT(绿色)和白色(以白色扇区为代表)的混合物，则将突变体视为嵌合体。我们观察到其他叶片表型，例如显示部分或完全色素缺失的叶片表型(图4b)。最终，在56株T0植物中，我们获得了39株黄绿色(69.6%)、7株白化(12.5%)、7株白斑(12.5%)和3株半绿半黄(5.4%)(图4b和4c)。突变体命名为chli。检测了5个独立的细胞系，4个黄绿色突变体(chli-2#、chli-4#、chli-5#、chli-6#)和1个白化突变体(chli-51#)，并测定了这5个细胞系的Chl含量。对于白化突变体chli-51#几乎没有产生叶绿素，而黄绿色突变体chli-2#， chli-4#， chli-5#， chli-6#的Chla和Chlb含量不到野生型的一半。
与WT相比，所有这些突变体均具有显著降低的Chl水平(图4d)。在这些突变体中，选择23个进行测序。各种突变的频率和序列见图4e。大多数黄绿色突变体包含一个复杂的突变。14个基因编辑品系检测到WT序列，其余黄绿品系未检测到WT序列。-CTAA…GGT (indel 26 bp)和-ACCC…TCG (indel 32 bp)突变事件发生在大多数黄绿色突变体中。白点突变也包含复杂的突变，但绝大多数均检出WT序列。对于半绿半黄的突变体，绿色组织产生野生型序列，而黄色组织显示突变型序列。值得注意的是，6例白化病表明纯合突变，即在与p240相同的突变位点上有一个单碱基替换(G到a)(图4f)。因此，我们证实p240表型与FpCHLI的突变有关。纯合突变体的白化叶片难以移植，因此我们进一步研究了与杂合p240突变体表型相似的黄绿色叶片突变体。叶绿素生物合成基因的稳态积累在chli4#中被下调(图4g)。为了研究FvCHLI缺陷是否影响叶绿体的发育，我们比较了野生型、组织培养的野生型、chli-4#和chli-51#叶绿体的超微结构。如图4f所示，野生型和组织培养的野生型在叶肉细胞中都有发育良好且有组织的叶绿体。而在chli-51#的叶绿体中几乎没有堆积的基粒，chli-4#的叶绿体中基粒堆积较松散，与p240相似(图4h)。除了这些表型，我们还测定了Proto IX和Mg-Proto IX的含量，表明野生型和突变型之间的Proto IX水平没有显著差异。然而，所有突变体均显著降低了Mg-ProtoIX(图4i)。这些观察表明，缺陷的FveCHLI导致叶绿体发育异常和叶绿素生物合成受损。
3.4 Chli突变体在弱光处理下表现为叶绿素积累
我们观察到，p240对光敏感，在高光强度(300 μmol m-2 s-1)下叶片呈黄绿色，而在温室中种植时，在弱光条件(50 μmol m-2 s-1)下叶片呈淡绿色(图S8)。为了确定杂合子chli是否与p240具有相同的表型，我们在生长室中以不同的密度生长chli-4#和chli-5#。chli突变体在351 μmol m-2 s-1时表现出较低的光饱和点，而光补偿点与野生型相似。所有WT和chli突变体都用300 μmol m-2 s-1和50 μmol m-2 s-1的光强度处理7天，导致叶片颜色发生明显变化(图5a)。如图5b所示，在强光条件下，chli突变体的叶片呈黄绿色，叶绿素的积累少于WT。相反，在50 μmol m-2 s-1的光强下，突变体的叶片颜色和Chl含量均高于突变体(图5b)。
研究了其对光合作用的影响。如图5c所示，在全光条件下，与WT相比，chli突变体的净光合速率和气孔导度均显著降低。然而，当植物在50 μmol m-2 s-1下生长时，chli的净光合作用和气孔导度显著高于WT(图5c)。此外，核编码光合作用相关基因FveLhca和FveLhcb(编码光收集复合体，LHCⅠ和LHCⅡ)在强光下表达下调，而在弱光条件下表达上调，这一点通过转录本的逆转录定量PCR (RT-qPCR)扩增得到证实(图5d)。此外，有报道称Chl水平与叶绿体发育有关，因此我们通过TEM分析叶绿体形态。观察结果显示，与野生型相比，300 μmol m-2 s-1的光强下，chli-4#黄绿色叶片的类囊体堆积较少。然而，在低光强下，突变体叶片的叶绿体恢复正常(图5e)。
3.5 氮和碳的代谢在叶绿体中受到影响
对p240和WT叶片转录本的RNA-Seq分析显示，814个DEGs中有497个(61.1%)与代谢相关，包括淀粉和蔗糖代谢、氨基酸代谢、苯丙烷生物合成和类黄酮代谢(图S9a)。为了进一步表征黄绿色和正常叶片中代谢物的状态，我们利用CRISPR/Cas9产生的chli突变体的成熟叶片，利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行了非靶向代谢组学分析(图6a)。主成分分析(Principal component analysis, PCA)显示6个样本被分为两个368个独立的聚类，表明WT和chli之间存在差异(图S9b)。
在比较WT和chli时，我们注释了298种差异累积的代谢物。聚类分析表明，298种代谢物包括49种类黄酮、42种氨基酸及其衍生物、28种脂酰、23种碳水化合物及其结合物、21种苯类、11种萜类和其他(图S9)。根据变量重要性投影(variable importance in projection, VIP)≥1和变化倍数(fold change, FC)≥2或≤0.5对差异累积代谢物进行评分。与WT相比，共有252种代谢物显著富集，98种代谢物在chli中以较低水平积累，154种代谢物在chli中显著增加(图6b)。这些增加的代谢物包括大多数氨基酸、几种核苷酸、羧酸、脂肪酸和酚(图6b)。氨基酸的相对积累，例如天冬酰胺，l -丝氨酸，精氨酸，谷氨酸和缬氨酸，在chli中显著较高(图6c)。代谢物的减少主要富集在大多数类黄酮、几种香豆素、碳水化合物、木脂素和脂肪酸(图6c，补充表S5)。
值得注意的是，大多数(42/49)的黄酮类化合物在chli中的含量低于WT。主要的黄酮类化合物，儿茶素，槲皮素，柚皮素，大豆苷元和山奈酚都降低了(图6d)。通过RT-qPCR检测类黄酮生物合成相关基因的相应转录水平。结果表明，这些转录本中的大多数在chli中积累到较低的稳态水平(图6e)。此外，黄酮类化合物和木脂素的生物合成通常被认为是C代谢的主要终产物。此外，黄绿色叶片的大部分碳水化合物及其共轭物(如葡萄糖-1-磷酸、d -甘露糖- 6-磷酸、d -葡萄糖-1,5-内酯、木糖醇、3-磷酸甘油酸和d -山梨醇)含量较低。因此，在黄绿色叶片中，氮同化被组成性地促进，而碳同化被抑制(图6d)。
3.6 FpCHLI错义突变不影响亚细胞定位
对栽培草莓TaiKong2008的原生质体进行亚细胞定位。FpCHLI-GFP和FpCHLI-GFP均与叶绿体的红色自发荧光共定位(图S10)。结果表明，FpCHLI错义突变不影响亚细胞定位
3.7 CHLI突变导致镁螯合酶和atp酶活性降低
为了进一步研究CHLI在草莓Chl生物合成中的作用，我们对FveCHLI和FveCHLI的结构进行了预测。从NCBI数据库获得FveCHLI蛋白序列。将第186位谷氨酸变为赖氨酸，获得Fvechli序列。使用Swiss-Model工具进行结构预测，并用PyMOL进行可视化。预测的结构表明，突变氨基酸(E186K)使186与相邻氨基酸之间的氢键减少，与VAL189和GLY191的氢键消失，LYS186更倾向于与HIS230结合(图7a和7b)。由于CHLI亚基与CHLD形成双环复合物，因此通过酵母双杂交实验检测突变是否影响CHLI、CHLD和CHLH之间的相互作用。
Y2H检测表明，FpCHLI和FpCHLI均可与FpCHLD结合，BiFC进一步证实了这些结果(图7c和图7d)。然而，在体内和体外，Fpchli和Fpchli之间的相互作用均弱于Fpchli和Fpchli，而Fpchli和Fpchli之间的相互作用仅在体内受损(图7c和7d)。之前的研究报道，BchI (CHLI)亚单位由于其特殊的结构，负责催化反应中的ATP水解，ATP结合基序列Walker A (GTGKSTA)和Walker B (LYIDE) 。p240的突变位点靠近Walker A和Walker B(图S5)，因此我们分析了突变体和WT的ATPase和MgCh活性。如图7e所示，相同条件下，p240、chli-2#、chli-4#、chli-5#和chliRNAi-1#的ATPase和MgCh活性只有WT的50%左右。与野生型相比，chliRNA -3#和chliRNAi-4#的atp酶和MgCh活性均无显著差异。因此，修饰后的FveCHLI亚基缺乏atp酶和MgCh，抑制叶绿素的合成。
04
结论
综上所述，FpCHLI的Glu186通过影响CHLI的组装和相关的atp酶活性来影响Chl的生物合成。杂合型Chl-less突变体在弱光条件下产生更多的Chl含量，导致其表型为浅绿色。进一步的研究表明，这些突变体促进了氮同化。综上所述，我们证明了Glu186对于Chl的正常生物合成是必需的，并且操纵CHLI可能是改善草莓在低光环境(如植物工厂)中的一种有前景的策略。
图8。chli突变体叶片影响的代谢物网络示意图总结
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