题目：The domestication-associated L1 gene encodes a eucomic acid synthase pleiotropically modulating pod pigmentation and shattering in soybean
刊名：Molecular Plant
作者：Bin Liu, Li-juan Qiu et al.
单位：Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences
日期：19 June 2023
01
摘要
豆荚颜色是大豆的一种驯化相关性状，现代品种的豆荚通常呈棕色或褐色，而它们的野生亲本甘氨酸大豆(Glycine soja)的豆荚则呈黑色。然而，调节这种颜色变化的因素仍然未知。在本研究中，我们克隆并鉴定了大豆中负责黑荚的经典基因座L1。
通过图谱克隆和遗传分析，我们确定了L1的致病基因，并发现它编码一个羟甲基戊二酰辅酶a (CoA)裂解酶(HMGL-like)结构域蛋白。生化分析表明，该基因具有红果酸合成酶的功能，可促进红果酸和番石榴酸的合成，而红果酸和番石榴酸是大豆豆荚和种皮着色的重要物质。
我们发现L1植株在光照下比L1零突变体更容易发生荚果碎裂，因为深色色素沉积增加了光热效率。因此，在大豆驯化和改良过程中，L1对豆荚颜色、碎裂以及种子色素沉着的多效性效应可能导致了对L1等位基因的偏好。总的来说，我们的研究为豆荚着色的机制提供了新的见解，并为未来豆科作物的重新驯化确定了新的目标。
02
技术路线
CRISPR–Cas9-engineered mutants were generated on the background of R171-BLk.
BSR-seq、Map-based cloning of L1 locus
Primers, accession numbers, and vector construction
Sample collection, RNA extraction, and qRT‒PCR
Soybean transformation
Protein domain and phylogenetic analysis
Metabolite extraction and analysis、Purification of the expressed His-tag protein
Gene diversity analysis、Enzyme assay
03
主要结果
3.1 L1候选基因的图谱克隆
为了了解黑豆荚向非黑豆荚转变的分子机制，我们对两个近等基因系R171-BLk(黑色豆荚)和R171-LBn(浅棕色豆荚)进行了杂交。这些NILs来源于重组自交系(RIL) R171，该自交系是由ZP03-5373和中黄13杂交而成(补充图1)。F2群体的遗传分析显示，黑色荚果和浅棕色荚果的分离率为3:1 (χ2(1:3) = 0.05 < χ2 0.05 = 3.84)(图1A)，表明荚果的深色色素沉着由单个显性基因控制。以前的研究表明大豆的黑豆荚和污种皮之间存在相关性(Owen, 1928)。与这些发现一致，我们在R171-BLk中观察到斑种皮，而在R171-LBn中没有(补充图1)。此外，在F2和F2:4群体中，斑种皮与黑色荚果共分离(图1A)，这表明L1位点对黑色荚果色素沉着和种皮污斑外观都有贡献。
为了确定大豆黑豆荚着色的致病基因，我们对来自F2群体的30株黑豆荚和30株浅棕色豆荚植物的叶片进行了BSR-seq。经过严格的质量控制和数据过滤，我们共鉴定出149157个高质量的snp。采用等位基因频率差>0.8和连锁概率>0.05作为筛选标准，我们发现229个SNP标记与黑豆荚显色有高概率关联(补充表S1)。其中，185个SNP标记(80.8%)定位于跨越19号染色体36.5-38.2 Mb区域的1.7 Mb基因组间隔，该区域与L1位点重叠(图1B) 。
为了进一步缩小L1位点的定位范围，我们对F2:4群体(n = 2662)进行了重组筛选，并在标记M5和M8之间发现了一个16.2 kb的区域，该区域仅包含一个推定基因Glyma.19G120400 (Wm82.a2.v1)的一部分(图1C)。我们在两个亲本系中对Glyma.19G120400进行了测序，并在第一个外显子的第91个核苷酸上发现了一个C-to-T变异，导致氨基酸从精氨酸替换为半胱氨酸(p.R31C)(图1C)。qRT-PCR分析显示，Glyma.19G120400主要在荚果中表达，随着荚果发育成熟，其表达水平逐渐升高(图1D)。然而，该基因的表达在NILs (R171-BLk和R171-LBn)之间没有显著差异(补充图2A)，这表明C91T变异可能在转录后水平影响基因功能。这些发现表明Glyma.19G120400是L1位点的一个强有力的候选基因。
3.2 负责黑豆荚颜色的L1基因的遗传确认
为了测试该候选基因的作用，我们利用CRISPR-Cas9技术敲除R171-BLk背景下的Glyma.19G120400。我们获得了多个独立的突变系，包括l1-cr1的单碱基插入和l1-cr2的68碱基插入在第一个外显子。表型分析显示，Glyma.19G120400基因功能障碍导致豆荚颜色从黑色变为浅棕色(图2A和2B)，表明Glyma.19G120400是L1位点的致病基因。
我们将R171-BLk中的Glyma.19G120400称为L1，将其在R171-LBn中的功能缺失变体称为L1 -1。有趣的是，敲除L1基因也消除了污斑种皮表型(图2A)，支持L1基因影响荚果和种皮颜色的观点。
为了进一步研究L1基因的作用，我们从R171-BLk中扩增出L1编码DNA序列(CDS)，并在CaMV 35S启动子的控制下，将L1编码DNA序列转化为浅色荚果品种TL1。表型分析显示，两个独立的转基因过表达系L1-OE1和L1-OE2产生黑色荚果，而不是野生型TL1植株中观察到的浅棕色荚果(图2C和2D)。进一步证实Glyma.19G120400为L1基因。
图2 L1基因的表征。
(A)野生型植株(R171-BLk)和crispr - cas9工程Glyma.19g120400突变体(l1-cr1和l1-cr2)的荚果和种子表型。
(B) Glyma.19g120400基因的基因组结构示意图。橙色字母表示靶向候选基因L1的第一个外显子的两个单导rna。线条上方的红色字母表示crispr - cas9介导的l1突变体中核苷酸插入的位置。浅蓝色方框表示5 '未翻译区(utr);白框表示外显子;黑线是内含子。
(C)野生型植株(TL1)和2个转基因glyma .19g120400.1过表达系的荚果颜色。
(D) L1基因在指示植物叶片中的表达水平。
(E)L1及其同源物的邻居连接系统发育树。
(F)水稻和拟南芥L1蛋白结构域及其同源物。红框表示叶绿体转运肽(CTP);蓝色矩形表示类hmgl域;黄色矩形表示LeuA二聚化结构域。
(G) L1-GFP融合蛋白在烟叶原生质体中的亚细胞定位。
3.3 L1编码一个hmgl样结构域蛋白
通过对蛋白序列的分析，我们发现L1蛋白具有高度保守的n端hmgl样结构域和c端LeuA调节结构域。HMGL-like结构域蛋白被归类为re - tim金属水解酶超家族的一部分，其促进C-C键的裂解或缩合反应，并可进一步分为四个不同的亚群:clisen -condensation-like (CC-like)， carboxyase -like, lysase -like和aldolase-like。
我们通过比对来自几个物种的L1同源蛋白，生成了包含203个成员的系统发育树(图2E)。分析发现L1蛋白与α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)和甲基硫代烷基苹果酸合成酶(MAM)密切相关，属于CC-like亚群。在这个亚群中，酶催化乙酰辅酶a和各种α-酮酸之间的缩合反应，从而产生2-苹果酸衍生物和辅酶a 。
值得注意的是，该亚群表现出显著的功能多样性，迄今为止至少有六种酶显示出不同的底物特异性。我们的分析显示，系统发育树上的203个分类群主要分为三个亚群，每个亚群可能具有不同的底物特异性(图2E)。例如，IPMS1/2是一种必需的酶，它可以催化2-酮异戊酸和乙酰辅酶a生成2-异丙基苹果酸。此外，MAM1/3通过与乙酰辅酶a凝聚ω-甲基硫代-2-氧烷酸来促进硫代葡萄糖苷的形成。
尽管与拟南芥和水稻同源物具有59%-67%的序列同源性，但L1蛋白形成了一个单独的亚群，其成员仅来自豆科物种(图2E)。与其同源物相比，L1蛋白缺乏叶绿体转运肽，定位于细胞质中(图2F和2G;补充图2C) (Field等人，2004;Textor et al.， 2007)。这些观察结果表明，L1蛋白的进化方式不同，可能导致大豆中缩合反应的底物特异性不同。
3.4 红果酸和番石榴酸是豆荚色素沉着的原因
为了研究导致豆荚不同颜色的化合物，我们利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)系统分析和比较了不同等位基因的未成熟豆荚的代谢物。我们的代谢组学分析显示，在R171-BLk和L1-OE1豆荚提取物中存在两种主要成分(C1和C2)，而在R171-LBn、l1-cr1或TL1豆荚提取物中不存在(图3A)。通过碎片化分析，我们推断出C1可能是鱼酸，其质量电荷比(m/z)为255.0534 ([m - h]−)，而C2可能是铕酸，其m/z比为239.0586 ([m - h]−)。为了进一步验证，我们将这两种化合物的色谱柱保留时间和质谱数据与市售标准品进行了比较，明确确认它们是鱼酸和真comic酸(图3B)。
鱼酸和真豆酸最早分别从牙买加山茱萸的树皮和刺花百合的球茎中分离出来。我们发现这些化合物在黑色豆荚中很丰富，但在棕色或棕色豆荚中却没有(图3C)。这些化合物是具有抗氧化性能的酚酸。某些酚酸及其副产物可以进行聚合，从而形成色素化合物，如木质素和单宁。这些酸还可以作为蛋白质交联的潜在试剂，导致酚-蛋白质相互作用和相应的颜色变化。R171-BLk和L1-OE1豆荚的深色很可能是由于富含鱼酸和真喜酸。与这一假设相一致，我们观察到从未成熟的R171-BLk豆荚中获得的浅绿色提取液在3天内逐渐变暗，而从l1-cr1豆荚中获得的提取液保持其浅绿色(图3D)。
为了研究红果酸和番石榴酸对豆荚颜色的影响，我们在l1-cr1豆荚提取液中添加了与R171-BLk豆荚提取液中相同浓度的红果酸和番石榴酸，并以水作为阴性对照。结果表明，在3天的时间里，添加红果酸和番石榴酸导致l1-cr1豆荚提取液逐渐变暗，与黑色豆荚提取液相似(图3D)。相反，当这些化合物加入水中时，没有观察到颜色变化(图3D)。这些结果表明，真豆酸和鱼酸在成熟豆荚黑色色素的形成中起着至关重要的作用。
3.5 L1的功能是真糖酸合成酶
考虑到红果酸是2-苹果酸衍生物，我们假设L1蛋白可能通过缩合反应合成该化合物，该缩合反应涉及酪氨酸代谢途径中的2-氧-单羧酸中间体4-羟基苯基丙酮酸(4-HPP)和乙酰辅酶a。为了验证这一假设，我们进行了体外实验来评估L1蛋白的活性。简而言之，我们将L1和L1 -1基因型的CDS克隆到pCold-TF载体上，将构建物转化到大肠杆菌BL21中，并使用镍腈三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖纯化重组蛋白(图4A)。
正如预期的那样，纯化的重组L1蛋白在含有4-HPP和乙酰辅酶a的混合物中表现出有效的真糖酸合成酶活性(图4B)。相比之下，l1R31C蛋白无活性，表明氨基酸变化(p.R31C)破坏了L1蛋白的功能(图4B)。此外，L1的生化表征表明，其对4-HPP的Km为53.19±3.91 μM，催化效率(kcat/Km)为13.9±1.8 mM−1 s−1(图4C)。这些数值与4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶和4-羟基苯基丙酮酸还原酶的催化效率相似，它们分别负责4-HPP的氧化和还原(Häusler et al.， 1991;Wang等人，2017)。从α-酮酸和乙酰辅酶a缩合反应中，很难直接生成红果酸。鉴于红和番石榴酸在结构上的高度相似性(Heller和Tamm, 1974)，我们认为番石榴酸可能以未知的机制由红果酸衍生而来(图4D)。综上所述，我们的数据表明，L1对于红果酸和番石榴酸的生物合成至关重要，这两种酸都有助于豆荚的黑色色素沉着。
3.6 L1强化了光热效应对荚果破碎的影响
物体可以吸收光并通过通常称为光热效应的过程将其转化为热能(Terazima et al.， 2004)。这种效果在深色物体上尤为明显。然而，对不同颜色豆荚光热效应的研究很少。为了解决这个问题，我们比较了来自L1基因编辑系(L1 -cr1和L1 -cr2)的黑色荚果(R171-BLk)和浅棕色荚果在模拟阳光(光合有效辐射，约1000 μmol m−2·s−1)下的温度。我们对红外图像的分析显示，在光线照射的前30秒，黑色豆荚的温度变化明显比浅棕色豆荚更明显(图6A和6B)。1 min后，黑色荚果的温度从25℃上升到50℃，而浅棕色荚果的温度只上升了17℃(图6B)。此外，5分钟后，黑豆荚的温度稳定在61℃，与浅棕色豆荚的温度相差11℃(图6C)。这些结果表明，短时间光照下，黑色豆荚的温度升高迅速而强烈，长时间光照下，黑色豆荚的温度高于非黑色豆荚。
温度是影响大豆落荚的关键因素。这一观察结果提出了一个有趣的问题，即L1基因在光照条件下对豆荚破碎的贡献。因此，我们比较了R171-BLk和两个L1基因编辑系在模拟阳光条件下的落荚倾向。结果表明，与l1-cr1和l1-cr2系相比，R171-BLk系的黑色荚果更易碎裂。这些结果表明，l1介导的荚果色素沉着与大豆光热诱导的荚果碎裂有关。
为了研究L1在农业实践中对大豆落粒的影响，我们在中国海南省进行了田间试验。我们测量了植株完全成熟时(当所有荚果达到成熟颜色时)和3周后的落荚率(图6D)。田间试验表明，只有一小部分突变株(l1-cr1, 1.31%;11 -cr2, 0.41%)在成熟期产生了落粒荚果，而R171-BLk系的这一比例超过38.73%(图6E)。突变体的单株碎荚率(11 -cr1, 0.39%;l1-cr2, 0.05%)显著低于R171-BLk系(6.44%)(图6F)。
延迟收获会加剧大豆的荚果破碎(Zhang and Bellaloui, 2012)。成熟3周后，约50%的突变系至少有一个落荚，但这一比例仍远低于R171-BLk系的96.24%(图6G)。浅棕色荚果抗碎性显著(111 -cr1, 13.61%;11 -cr2, 11.52%)，而黑色荚果破碎率高达62.98%(图6H)。这些结果表明，对L1基因进行精确的基因组编辑可以通过减少大豆豆荚色素沉着，显著提高大豆在田间的抗落荚性。因此，对抗落荚性的偏好很可能促成了栽培大豆品种l1等位基因的人工选择(图7)。
L1作为一种红果酸合成酶，促进红果酸和番石榴酸的合成，导致豆荚呈黑色。豆荚的深色提高了光热转换效率，促进了豆荚的破碎，有利于大豆的成活率。在大豆驯化和改良过程中，筛选出了荚果颜色浅、抗落荚的l1H2、l1H3和l1H4等位基因。
04
结论
在本研究中，我们利用图谱克隆技术发现了编码豆荚中所必需的豆荚科特异性羟甲基戊二酰辅酶a (CoA)裂解酶样(HMGL)结构域蛋白的L1基因。此外，我们的研究结果表明，与L1无突变体相比，L1基因在光条件下对荚果和种皮的颜色以及荚果脱落具有多效性作用，这表明L1介导的荚果深色色素沉着加剧了光热效应对荚果脱落的影响。
我们已经确定L1是一种至关重要的红果酸合成酶，从而增强了我们对hmgl样结构域家族酶活性的了解。我们的研究结果还揭示了L1在大豆豆荚和种子色素沉着及其间接促进豆荚破碎中的多方面调节作用。因此，L1可以被认为是大豆重新驯化的潜在靶点，以增强大豆抗碎荚性和提高种子品质。
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原文获取
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1674205223001697
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-226.html
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