题目：The COPII subunit CsSEC23 mediates fruit glossiness in cucumber
刊名：The Plant Journal
作者：Luyao Gao, Tao Wu et al.
单位：Hunan Agricultural University, Changsha
日期：17 July 2023
01
摘要
为了更好地理解黄瓜光泽度调节的机制，我们鉴定了一种新的具有光泽果皮的黄瓜突变体（Csgp）。MutMap、基因分型和基因编辑结果表明，作为COPII囊泡的核心成分的CsSEC23介导黄瓜果皮的光泽度。CsSEC23功能保守，位于高尔基体和内质网中。CsSEC23可以与CsSEC31相互作用，但这种相互作用在Csgp突变体中不存在，这降低了COPII囊泡运输的效率。与蜡和角质运输相关的基因在Csgp突变体中上调，并且Csgp突变果皮的角质层结构变得更薄。此外，由于CsSEC23突变，蜡和角质的含量也发生了变化。总之，本研究的结果表明，CsSEC23介导黄瓜光泽度，并且这种介导可能受到COPII囊泡运输的影响。
02
技术路线
Determination of wax powder content on cucumber
surface
Glossiness analysis
Genetic analysis
Whole genome resequencing、Bioinformatics analysis
Acquisition of gene-edited-positive plants
qRT–PCR analysis、Colocalization analysis
Dual luciferase assay
Interaction protein screening、Yeast two-hybrid (Y2H) assay
03
主要结果
3.1 黄瓜光泽皮突变体（Csgp）的表型特征
Csgp突变体是在我们以前的EMS诱变文库的M2突变体群体中鉴定的。与野生型相比，Csgp突变体的果皮明显更光滑（图1a）。Csgp果皮的光泽度为34.05 0.51，野生型为30.32 0.38（图1b）。据报道，蜡粉含量会影响植物光泽度（Ji et al.，2018）。为了探讨蜡粉含量是否影响Csgp突变体的光泽度，测定了黄瓜蜡粉含量，结果表明野生型和Csgp突变株的蜡粉含量没有显著差异。野生型的蜡粉含量为8.35 0.53，Csgp突变体的蜡粉浓度为9.21 0.05（图1c）。与野生型相比，Csgp突变体更光滑，但这种差异与蜡粉含量无关。
3.2 Csgp突变体靶基因的鉴定
CsDULL（CsGLF1，CsTU，基因ID:CsaV3_5G028870）可以影响黄瓜光泽度。为了确定Csgp突变体中的CsDULL和候选基因是否是相同的基因，我们比较了Csgp突变体和野生型中CsDULL基因的启动子和基因组DNA序列。结果表明，Csgp突变体和野生型之间的CsDULL基因启动子和基因组DNA序列没有突变（图S1）。CsDULL的丢失导致了一个非损失表型，因此我们还检查了其他无毛基因是否发生突变，这可能会影响黄瓜的光泽度。
根据我们的全基因组重测序结果，我们发现野生型和Csgp突变体之间的EAT3（CsTOE3）、GLABROUS1（CsGL1）和CsGL3的TARGET的启动子和基因组DNA序列没有突变。这一结果表明，Csgp突变体中的候选基因是一个调控黄瓜光泽度的新基因。将Csgp突变体与野生型杂交进行遗传分析和基因鉴定。所有F1植株均表现为野生型表型，果皮无光泽。由此产生的F2子代表现出光泽表型和非光泽表型的分离。在138株植物中，32株表现出有光泽的果皮表型，106株表现出野生型无光泽果皮表型。有光泽和无光泽植株的分离比一致为1:3（v2=0.067，P<0.05）（表1），这表明黄瓜Csgp突变体的有光泽果皮表型由单个隐性基因控制。
考虑到Csgp突变体的单隐性遗传特征，然后使用MutMap技术鉴定介导黄瓜果皮光泽度的候选基因。突变体由在F2群体中表现出光泽果皮的30株植物组成，而一株野生型植物用于野生型体。共有61 864 739（90.41%）和80 395 546（92.90%）个reads被映射到黄瓜参考基因组(ftp://www.icugi.org/pub/genome/cucumber/Chinese_long/v2/）分别在野生型和突变型中（表S1）。计算黄瓜所有七条染色体的单核苷酸多态性（SNP）指数，获得525 291个SNP和97 416个INDEL（图2a）。
在候选区域中总共选择了10个SNP突变位点（表S2；图2b）。然后使用具有117株单株的F2分段门控群体，通过竞争性等位基因特异性PCR（KASP）对10个SNP突变位点进行基因分型。结果表明，SNP1 20878004的基因型，即Chr5的20878004.中的一个非同义突变G-to-a SNP位点，与F2分离群体中的表型共分离（图2b；表S3和S4）。然而，F2分离群体中其他SNP的基因型与表型不一致（表S3）。这些结果证实了含有SNP1 20878004的Csa5G585430可能是Csgp突变体的候选基因。
序列分析表明，Csa5G585430编码转运蛋白SEC23。在本研究中，Csgp突变体中的候选基因称为CsSEC23，非同义G-to-A命名为CsSEC23A。
利用CRISPR-Cas9技术鉴定CsSEC23在调节黄瓜光泽度中的生物学功能。在黄瓜品种KT中使用CRISPR–Cas9系统获得纯合基因编辑突变体。鉴定了两个基因编辑系，即缺失5 bp的Cssec23cr-2和插入19 bp的Cssec23cr-3，用于进一步表征（图2c；图S2）。基因编辑植株的果实光泽度显著强于KT植株（图2d）。Cssec23cr-2果皮的光泽度为43.18 0.95，同样，Cssec23 cr-3果皮的光泽为40.34 0.52，而KT的光泽仅为31.48 0.93（图2e）。这些结果表明，CsSEC23调控黄瓜光泽度。
图2 CsSEC23介导了Csgp果皮的光泽度。
（a） 单核苷酸多态性指数在黄瓜7条染色体上的分布。
（b）黄瓜Chr5上的10个SNPs和Csa5G585430的预测结构。
（c） CRISPR–Cas9使用两个gRNA产生的CsSEC23突变。显示了KT中两个Cssec23突变体的序列。
（d） Cssec23cr-2、Cssec23cr-3和KT在花后10天的果实。
（e）Cssec23cr-2、Cssec23cr-3和KT黄瓜的光泽度。
3.3 CsSEC23在功能上保守，位于高尔基体和内质网
为了初步探讨CsSEC23在黄瓜光泽度中的作用，基于系统发育树比较分析，我们发现黄瓜中存在5个CsSEC23-同源基因，其中CsSEC二十三和AtSEC23A关系最密切（图3a）。此外，与酵母、拟南芥和其他物种中的结构域相比，CsSEC23结构域高度保守（图S3）。CsSEC23A也属于这个高度保守的家族，特别是锌指结构域。
为了研究CsSEC23介导的黄瓜光泽度的保守性，我们检测了29份欧亚黄瓜、37份东亚黄瓜、30份印度黄瓜和19份西双版纳黄瓜的SNP120878004基因型。结果表明，115个品系中有43个携带A等位基因，63个携带G等位基因。结果表明，具有CsSEC23A的有光泽果皮类型与欧亚种群密切相关，占最大比例（62.07%）。
为探讨CsSEC23在黄瓜不同器官中的表达模式，采用定量实时PCR（qRT-PCR）和原位杂交技术对其进行了研究。在Csgp突变体中，CsSEC23在叶片、雄花、子房和果皮中的相对表达显著下降，然而，野生型和Csgp突变体之间的茎和雌花没有显著差异（图3b）。为了进一步确定点突变对CsSEC23表达的影响，我们在点突变位点前后设计了两对引物来分析基因表达。结果表明，在突变位点之前/之后，CsSEC23的表达显著下降（图S5）。
考虑到果实光泽度主要发生在果皮中，因此对整个子房进行原位杂交，以进一步研究CsSEC23在果实中的表达。原位杂交进一步证实，CsSEC23转录物富集在果皮中（图S6）。
为了进一步阐明CsSEC23的功能，选择了高尔基体标记和ER标记来分析CsSEC23的共定位，我们发现CsSEC2 3位于高尔基体和ER中（图3c，d）。推测CsSEC23的保守功能可能影响黄瓜中COPII囊泡的功能，并调节黄瓜的光泽度。然而，没有关于COPII调节植物光泽度的报告。
图3 CsSEC23的守恒函数分析。
（a） 植物（拟南芥、水稻和黄瓜）、绿藻（莱茵衣藻）、哺乳动物（小鼠）和酵母（酿酒酵母S288C）中SEC23同源物的系统发育树。
（b） CsSEC23在野生型和Csgp中的相对表达
（c） 在烟草叶表皮细胞中瞬时表达CsSEC23，并与高尔基体标记共定位。
（d） 本研究利用内质网标记技术，将CsSEC23瞬时表达于叶表皮细胞。
3.4 CsSEC23基因突变对COPII囊泡转运的影响
CsSEC23是COPII的重要组分，SEC23/24可形成复合物，SEC31可与SEC23结构域结合。为了探讨CsSEC23和COPII介导黄瓜光泽度的分子机制，我们分析了CsSEC23和CsSEC24/CsSEC31之间的相互作用。
酵母双杂交试验结果显示CsSEC23与CsSEC24/CsSEC31相互作用（图4a；图S7）。然而，当CsSEC23突变时，CsSEC23和CsSEC31之间的相互作用不存在，而CsSEC23仍然可以与Csgp突变体中的CsSEC24相互作用（图4b；图S7）。LUC实验和双分子荧光互补实验的结果与酵母双杂交实验的结果一致（图4c–f），这表明CsSEC23的突变会影响CsSEC23和CsSEC31之间的相互作用。结果表明，CsSEC23和CsSEC31介导的细胞运输相互作用可能在黄瓜果皮光泽度调控中起重要作用。
图4 与CsSEC23相互作用的蛋白质。
（a） 酵母双杂交实验结果表明，野生型CsSEC23与CsSEC31互作，而Csgp不互作；
（b） 萤火虫荧光素酶互补成像分析。nLUC-CsSEC23/nLUC-CsSEC23A和cLUC-CsSEC31在烟草中瞬时共表达
（c） 叶表皮细胞CsSEC23、CsSEC31和高尔基体标记的双分子荧光互补分析。
（d） 叶表皮细胞CsSEC23、CsSEC31和ER标记的BiFC分析。
（e） 叶表皮细胞CsSEC23A、CsSEC31和高尔基体标记的BiFC分析。
（f） 叶表皮细胞CsSEC23A、CsSEC31和ER标记的BiFC分析。
3.5 黄瓜光滑果皮的形成与角质和蜡质的运输有关
为进一步探讨COPII介导黄瓜光泽度的分子机制，利用野生型和Csgp突变体花后0d的子房果皮RNA样品进行RNA seq分析，鉴定CsSEC23的可能靶基因。通过比较野生型和Csgp突变体共鉴定出1250个差异表达基因（DEG），其中上调基因381个，下调基因869个。GO分析表明，DEG主要集中在细胞成分类别中的细胞器和细胞部分，以及生物类别中的代谢过程和细胞过程。
为了研究野生型与Csgp突变体之间与生化代谢途径和信号转导途径相关的DEGs之间的协同作用，对DEGs之间进行了显著的路径富集分析。结果表明，DEGs主要富集于11条KEGG途径，包括植物激素信号转导、苯丙烷生物合成、苯丙氨酸和α-亚麻酸代谢、β-丙氨酸代谢以及角质、子叶素和蜡质合成。以往的研究表明，与角质、角质和蜡质合成相关的基因可以调节植物的光泽度，蜡质和角质也可以影响植物的光泽度。
我们发现蜡和角质合成相关基因的相对表达是介导的，但呈现不规则的模式（图5a）；然而，与蜡和角质转运相关的主要基因的相对表达上调（图5b）。重要的是，与野生型相比，Csgp突变体中报告的黄瓜光泽介导基因CsDULL/CsGLF1的相对表达也下调。为了说明转录组数据的准确性，我们通过qRT–PCR分析了与蜡和角质合成和转运相关的基因，并且qRT–PCR结果与转录组测序一致，表明转录组数据是有效和可靠的。推测CsSEC23介导的COPII囊泡转运通过影响蜡和角质的转运介导黄瓜光泽度。
图5 Csgp和野生型果实角质层相关基因的热图变化。
（a） 差异表达基因（DEGs）参与果实蜡质和角质合成途径。
（b） DEGs参与果实中蜡质和角质的运输途径。
3.6 CsSEC23对黄瓜角质层角质和蜡质含量的影响
根据前人研究结果中观察到的表皮结构变化，通过对表皮成分的检测，进一步阐明了SEC23介导黄瓜光泽度的分子机制。采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定果皮中蜡质和角质含量的变化。结果表明，Csgp突变体的总蜡含量显著低于野生型（图6a）。野生型蜡质含量为23871.94±1867.10 ng cm-2，Csgp突变体蜡质含量为7098.83±552.19 ng cm- 2，说明野生型与Csgp的总蜡质含量存在差异。野生型的角质含量为233.50±17.84 ug cm - 2，Csgp突变体的角质含量为1441.84± 153.37 ug cm -2，表明Csgp突变体的总角质含量显著高于野生型（图6b）。
蜡由C20–C34 FAs的超长链脂肪酸（VLCFA）合成。蜡质中酯类和脂肪酸占黄瓜果皮总蜡质含量的比例较大，且Csgp突变体的酯类和脂肪酸含量显著低于野生型，如野生型蜡质中C29 FA含量为2044.71±156.79 ng cm-2，Csgp突变体蜡中C29 FA含量为137.64 ±33.60 ng cm - 2（图6c）。角质几乎完全由C16和C18单体组成，其中C18:2单体占角质的大部分。Csgp突变体角质中酯类和脂肪酸含量显著高于野生型。例如，野生型角质中C18:2 FA含量为0.58± 0.05 ug cm-2，Csgp突变体角质中C18:2 FA含量为6.23±0.51 ug cm-2（图6d）。在Csgp突变体中，蜡质单体的数量显著减少，角质单体的数量显著增加，最终导致Csgp突变体中角质的数量增加，蜡质的数量减少。结果表明，COPII的重要组分CsSEC23基因突变影响角质层中角质和蜡质的含量。
图6 黄瓜果皮蜡质和角质含量的测定。
（a） 野生型和黑果葡果皮总蜡含量。
（b） 野生型和黑果葡果皮总角质含量
（c） 野生型和Csgp果皮的蜡质成分
（d） 野生型和Csgp果皮的角质成分
3.7 CsSEC23介导的COPII囊泡转运对黄瓜角质层通透性和厚度的影响
研究表明，蜡和角质可通过COPII囊泡运输分泌到质膜（PM），最终形成角质层。因此，对野生型和Csgp突变体的角质层进行分析，进一步阐明黄瓜光泽度与角质和蜡质运输的关系。角质层通透性是反映角质层结构的重要指标，通过甲苯胺蓝染色实验研究了Csgp突变体和野生型角质层通透性的变化。染色后，Csgp突变体的果皮较深，果实横截面观察结果更清晰（图7a）。结果表明，Csgp突变体的角质层通透性强于野生型，说明野生型和Csgp突变体在蜡质和角质运输方面的差异影响角质层结构。Oil red O染色结果表明，Csgp突变体果实的角质层厚度比野生型果实薄（图7b）。与野生型相比，Csgp突变体的角质层发生了明显的变化，说明野生型与Csgp在蜡质和角质运输方面的差异影响了角质层的厚度，改变了角质层的结构。
用甲苯胺蓝染色法对Cssec23cr-2及其对照KT的角质层通透性进行了分析。结果表明，Cssec23cr-2果实的果皮甲苯胺蓝染色比KT果实的果皮甲苯胺蓝染色多（图7c），表明基因编辑的Cssec23cr-2植株的角质层通透性高于KT，说明KT与Cssec23cr-2在蜡质和角质转运方面的差异影响角质层结构。Oil red O染色结果表明，Cssec23cr-2果实角质层厚度较KT果实薄（图7d）。与KT相比，Cssec23cr-2的角质层发生了明显的变化，说明KT与Cssec23cr 2在蜡质和角质运输方面的差异影响了角质层的厚度，改变了角质层的结构。上述结果表明，CsSEC23基因的突变改变了黄瓜表皮的通透性，其保守功能在黄瓜表皮结构的形成中起一定作用。
图7 黄瓜果皮角质层分析。
（a） 甲苯胺蓝染色观察野生型和Csgp突变体果实花后10d角质层透性。
（b）甲苯胺蓝染色法观察野生型和Csgp突变体果实花后10d中部角质层透性。
(c)用oil red O染色法对野生型和Csgp突变体果实花后10天的表皮8 mm冰冻切片进行了显微观察。
（d） KT和Cssec23cr-2果实花后0天和4天角质层对甲苯胺蓝透性的宏观观察。
04
结论
本研究确定了黄瓜光泽度相关基因CsSEC23。克隆该基因后，分析其功能，证实CsSEC23对黄瓜角质层发育有一定影响，影响黄瓜光泽度。
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原文获取
原文链接：
https://doi.org/10.1111/tpj.16389
END
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