题目：The PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15 module regulates secondary vascular development in Populus
刊名：Plant Communications
作者：Xin-Qiang He, Lingyan Wang et al.
单位：Peking University, Beijing
日期：13 March 2023
01
摘要
次生维管发育是木本植物的一个重要生物学特性，也是木材形成的基础。我们对次生维管发育过程中微小RNA（miRNA）的基因表达调控和动态变化的理解仍然有限。在这里，我们对毛白杨的六个阶段特异性组织——茎尖、原形成层、初生维管组织、形成层、次生韧皮部和次生木质部——的miRNA和mRNA转录组进行了综合分析。在杨的次生维管发育过程中，发现了几个新的调控模块，包括PtoTCP2-miR396d-PtoGRF15模块。
一系列生化和分子实验证实，PtoTCP20激活了miR396d前体基因的转录，miR396d靶向PtoGRF15下调其表达。过表达miR396d（35S:miR396d）的植物表现出增强的次生生长和增加的木质部产量。相反，在从初级维管发育到次级维管发育的过渡过程中，PtoTCP20表达下调（PtoTCP20-SRDX）、miR396表达下调（35S:STM396）和PtoGRF15过表达（35S:PtoGRF15）的植物表现出次级生长延迟。
通过对miRNA和mRNA转录组的综合分析，鉴定了新的调控模块，并在杨树中验证了PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15信号级联在次生维管发育中的调控作用，为改善森林栽培和木材特性提供了信息支持。
02
技术路线
杨树遗传转化
RT–PCR和定量RT–PCR分析
序列分析
质粒构建
WGCNA
Brassinosteroid sensitivity assay
蛋白质提取、免疫印迹和共免疫沉淀分析、Subcellular localization
Bimolecular fluorescence complementation、pull-down assays、CoIP
03
主要结果
3.1 毛白杨维管束发育过程中基因和miRNA的动态表达
为了测定毛白杨维管发育过程中的转录组和miRNA动态，采用切向冷冻切片技术获得了杨树茎中的六个相特异性组织，包括茎尖、原形成层、初生维管组织、形成层、次生韧皮部和次生木质部。杨树的茎尖（SA）是一个不确定的初级分生组织，产生原皮组织、地面分生组织和原茎。原形成层由明显均匀的分生组织细胞组成，这些细胞在横切面上的直径很窄（补充图1B）。原形成层分化形成由初生韧皮部、束状形成层和初生木质部组成的初生维管组织。最后，束状形成层在初级-次级生长过渡带分级为形成层。形成层通过周膜分裂不断产生子细胞，这些子细胞分化为外部的次生韧皮部和内部的次生木质部。
RNA-seq和miRNA-seq在这六个阶段特异性组织上用三个生物重复进行。RNA-seq和miRNA-seq数据的主成分分析显示，18个样本被明确划分为六个发育阶段：每个阶段的样本聚集在一起，证实了同一阶段生物复制的总体转录组图谱的相似性（图1A和1D）。
分类分析显示，472、370、323和643个基因分别在SA、原发层、原发维管束组织和形成层中特异性表达，在SA原发层-形成层连续发育过程中共有23431个基因（图1B）。34、1426和1726个基因分别在形成层、次生韧皮部和次生木质部中特异性表达，在次生维管发育过程中共有25243个基因（图1C）。
通过注释和表达水平分析，成功鉴定出319个已知的miRNA序列。2个在原形成层中特异性表达，12个在原发维管组织中特异性，7个在形成层中特异性表达，在SA原形成层连续发育过程中共有117个miRNA（图1E）。形成层中有5个miRNA特异性表达，次生木质部中有1个miRNA，在次生维管发育过程中共有126个miRNA（图1F）。对未注释序列进行进一步分析，并预测其二级结构。对未标记序列的分析预测，514个小RNA是基于其典型发夹结构的新的候选miRNA。
选择不同发育阶段的标记基因来验证样本的特异性和准确性。例如，WUS同源物PtoWUS1和PtoWUS2、MP同源物PtoP1和PtoP2以及WOX4同源物Pto WOX4a和Pto WOx4b分别主要在SA、原形成层和形成层中表达。APL同源物PtoAPL1和PtoAPL2作为次生维管组织的标记基因，主要在次生韧皮部表达。VND7同源物PtoWND6A和PtoWND6B以及XCP2同源物PtoCCP2-1和PtoXCP2-2在次生木质部中特异性表达（补充图2）。根据qRT-PCR的结果，所有标记基因在其相应组织中的表达水平最高。这些基因的qRT-PCR结果和所有六种选定miRNA的表达水平与RNA-seq结果密切相关。
3.2 毛白杨维管发育过程中差异表达基因及转录因子分析
为了鉴定与维管分生组织维持和分化相关的表达变化的基因，我们在维管发育的连续发育阶段进行两两比较。在SA原形成层-形成层连续过渡过程中，有959个基因表达差异显著。在这些差异表达基因（DEGs）中，571个在SA中相对于原形成层上调，388个在SA中下调。原形成层和原发维管组织的两两比较显示182个上调基因和187个下调基因。原形成层相对于形成层有1514个上调基因和1888个下调基因，初生维管组织相对于形成层有1266个上调基因和1630个下调基因。形成层相对于次生木质部有778个上调基因和825个下调基因，形成层相对于次生韧皮部有7个上调基因和2个下调基因。
接下来，我们研究了相邻发育阶段之间DEGs组的TFs。结果显示，与原形成层相比，SA中差异表达的TFs有350个（上调202个，下调148个），原形成层中差异表达的TFs有155个（上调68个，下调87个），原形成层中差异表达的TFs有1123个（上调559个，下调564个），在SA原形成层-形成层连续发育过程中，初生维管组织相对于形成层中有984个DETF（490个上调，494个下调）。在次生维管发育过程中，相对于次生韧皮部，形成层中鉴定出3个DETF（2个上调，1个下调），相对于次生木质部，形成层中鉴定出254个DETF（81个上调，173个下调）。
为了获得在维管发育过程中确定的DEGs功能的更广泛的视角，确定了初级维管组织发育（SA、原形成层和初级维管组织）和次级维管组织发育（形成层、韧皮部和木质部）过程中的GO类别。氧化还原变化、碳水化合物代谢过程、细胞壁组织或生物发生以及纤维素代谢过程发生在毛白杨的初级至次级生长期间（补充图5D和5E）。这些上调和下调的DEG分为功能类别，包括TFs、表观遗传调控、小肽、蛋白激酶活性、细胞壁生物发生和修饰、植物激素信号转导、Ca2+信号通路和细胞周期相关基因（补充表2）。
3.3 利用WGCNA鉴定阶段特异性模块和hub基因
为了全面了解在整个维管发育的连续发育阶段表达的基因，并确定与维管分生组织发育高度相关的特定基因以及可能在从初级生长到次级生长的过渡中起重要作用的基因，进行WGCNA。在筛选出所有样本中低表达水平的基因后，WGCNA保留了9723个基因。采用动态树切割法将基因分为不同的模块，定义了10个模块，并用不同的颜色标记（图2A）。将特征基因定义为模块的第一主成分，该主成分可以表示该模块中基因的表达谱。
模块隶属度（kME）定义为一个基因与其所属模块的特征基因之间的相关系数。kME较高的基因也倾向于具有较高的模内连接性（与同一模块中其他基因的邻接总和），因此更可能是模块的中心基因。基因与性状（本例中为18个样本中的一个）之间的关系定义为性状的基因显著性，即基因表达谱与代表性状的数值向量之间的相关系数，模块显著性定义为其成员的平均基因显著性（图2B）。
图2：毛白杨维管发育过程中基因的WGCNA。
（A）显示WGCNA识别的共表达模块的分层聚类树。
（B） 模块示例关联。
（C） MEbrown模块中的基因热图和相关网络，在SA-PC-VC连续发育过程中逐渐下调。
（D） MEcyan模块中的基因热图和相关网络，在SA-PC-VC连续发育过程中逐渐上调。
（E） MEsienna模块中的基因热图和相关网络，在VC和SP中显著过表达。
（F） MEpink模块中的基因热图和相关网络，在SX中显著过度表达。候选hub基因以黄色显示。
3.4 RNA-seq与miRNA-seq整合分析鉴定miRNA-TF调控模块
为了探讨TFs是如何定义维管组织的发育阶段和相变的，我们选择了SA原形成层连续统和次生维管发育过程中的DEGs和DETFs进行共表达分析。选择Pearson相关系数（PCCs）大于0.7的TF基因对。由于TFs的保守结构域和靶基因的结合基序，成功地预测了许多TF/靶基因对。基因共表达分析和靶基因预测分别揭示了SA原形成层连续发育（补充图7A）和次生维管发育（补充图7B）期间1857和696 TF/靶基因调控关系。通过表达相关性和基因序列分析验证了这些关系。与其他基因有20种以上关系的TFs被定义为可能在杨树维管发育中发挥重要作用的hub TFs（补充图7）。
考虑到参与维管发育的miRNAs的大多数靶点是TFs，构建了miRNAs-TF网络，其中miRNAs和TFs在共表达网络中鉴定。miR166-PtoHB5、miR166-PtoHB8、miR139-PtoTCP20和miR396-PtoGRF15对被鉴定为miRNA hub-TF对（紫色矩形），miR164-NAC、miR393-bHLH、miR160-ARF、miR156-SPL和miR172-AP2被鉴定为miRNA非hub-TF对（红色矩形）（图3）。
图3：毛白杨维管发育过程中miRNAs-TFs靶基因的级联调控网络。
在杨树SA-PC-VC连续体发育过程中发现了几个调控模块。通过遗传转化、生化和分子分析证实了PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15信号级联在次生维管发育中的作用。蓝色六边形代表miRNA。矩形代表miRNA靶向的TFs；紫色矩形表示轮毂TFs，红色矩形表示非轮毂TFs。绿色圆圈代表TFs的靶基因。箭头表示TFs激活miRNAs。
3.5 PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15信号级联在毛白杨次生维管发育中的作用
为了验证上述miRNA-TF关系，选择miR319-PtoTCP20和miR396-PtoGRF15作为miRNA-hub-TF对进行进一步分析（图3）。在之前的一项研究中，我们报告了miR319a靶向的PtoTCP20通过与毛白杨中PtoWOX4和PtoWND6的相互作用促进次生生长。
为了研究PtoTCP20-miR396和miR396-PtoGRF15在维管发育过程中的作用，构建了PtoTCP20-SRDX、35S:miR396d、35S:STTM396和35S:PtoGRF15转基因植株。短串联靶点模拟（STTM）技术可以有效阻断内源性miRNA的活性。与野生型（WT）相比，PtoTCP20 SRDX株高显著降低，35S:STTM396株生长略短。35S:miR396d和35S:PtoGRF15植株在高度上没有显著差异（图4A和4G）。
为探讨PtoTCP20、miR396d和PtoGRF15在维管组织发育中的作用，对2月龄转基因和WT幼苗的横截面进行了分析。在第四节间，WT和35S:miR396d植株经历了完全的次生生长（图4B和4D）。如图4C和4E所示，PtoTCP20 SRDX和35S:STTM396植物的第四节间横截面显示初生维管束，而35S:PtoGRF15植物的第四节间存在维管形成层（图4F），表明从初生到次生生长的过渡。
与WT植物相比，35S:miR396d植物初生维管束间木质部细胞层数增加77.1%，而PtoTCP20 SRDX、35S:STTM396和35S:PtoGRF15植物分别减少81.3%、77.2%和50%（图4H）。通过构建转PtoTCP20-CRISPR基因植株，验证了PtoTCP20的内源功能。与PtoTCP20 SRDX植物一致，PtoTCP20 CRISPR植物的次生生长受损。结果表明，PtoTCP20和miR396d促进了原发性维管向继发性维管的转化和继发性维管的发育，而PtoGRF15则延缓了继发性维管的发育。
图4：2月龄野生型和转基因毛白杨第四节间的表型和横截面。
（A） WT、PtoTCP20 SRDX、35S:miR396d、35S:STTM396和35S:PtoGRF15植物的表型。
（B–F）WT和转基因植物第四节间的横截面。木质部细胞用红星标记。比例尺，100μm。
（G） 2月龄WT和转基因植株的高度。
（H） 2月龄野生型和转基因植株第四节间木质部细胞层。
利用20-21 bp的成熟序列（miRbase：http://www.mirbase.org)并根据其成熟序列3′端的变异进一步分组。杨树miR396分子分为两个类群。在第一组中，三个成员（miR396-a、-b和-f）共享相同的成熟miRNA序列。在组II中，miR396-c、miR396-d、miR396-e-5p和miR396-g-5p是相同的，并且miR396e-3p和miR396-g-3p是独特的序列（图5L）。双荧光素酶法检测PtoTCP20对miR396家族前体基因的激活。
从毛白杨基因组DNA中扩增miR396家族前体基因的启动子序列，插入pGreen II 0800-LUC载体，作为报告基因。从杨树总cDNA中扩增PtoTCP20的编码序列（CDS），插入pCAMBIA2300载体中，并用作效应器（图5A）。与仅表达miR396d-pro-LUC的烟草叶片相比，共表达35S:PtoTCP20和miR396d-pro-LUC的烟草叶片原生质体中荧光素酶/Renilla荧光素酶（LUC/REN）比值上调，表明PtoTCP20可以激活miR396家族的miR396d前体基因（图5E）。
然而，PtoTCP20对其他miR396家族前体基因没有影响（图5B–5D和5F–5H）。通过体外酵母单杂交试验验证PtoTCP20激活miR396d前体基因（图5I）。qRT–PCR分析显示，与野生型植物相比，35S:PtoTCP20植物的前体和成熟miR396d上调（图5J和5K）。原位杂交结果显示，TCP20和miR396d的表达从初生维管发育到次生维管发育逐渐增加，且主要在次生木质部共表达（补充图9）。
图5：PtoTCP20在体内外激活miR396d前体基因。
（A-H）双荧光素酶法检测PtoTCP20在体内对miR396家族前体基因的激活。与仅表达miR396d-pro-LUC的叶片相比，共表达35S:PtoTCP20和miR396d-pro-LUC的叶片原生质体中的LUC/REN比值上调。PtoTCP20对其他miR396家族前体基因无影响。
（I） 通过酵母单杂交实验检测PtoTCP20对miR396d前体基因的激活。以空载体pGADT7和pHIS2为阴性对照。
（J） 前体miR396d在35S:PtoTCP20植物中上调。
（K） 成熟miR396d在35S:PtoTCP20植株中上调。
（L） 对杨属9个miR396家族成员的序列进行了比对。
04
结论
对杨树维管发育过程中的RNA seq和小RNA测序进行了综合分析，并将新的相互作用（包括次生维管发育中的PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15）确定为杨树的调节模块（图7）。
miR396d在毛白杨初生维管发育至次生维管发育过程中的表达水平逐渐升高，而PtoGRF15的表达水平逐渐降低。PtoTCP20激活miR396d前体基因转录，miR396d靶向PtoGRF15调控其表达。35S:miR396d植株的次生生长增强，木质部产量增加，而35S:PtoGRF15植株的次生生长延迟。
通过遗传转化、生物化学和分子生物学实验验证了PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15信号通路在杨树次生维管发育中的作用，为杨树人工林培育和木材性质改良提供了重要信息。
图7：PtoTCP20-miR396d-PtoGRF15模块在毛白杨次生维管发育中的模型。
PtoTCP20和miR396d的表达水平在原发性维管发育至继发性维管发育过程中逐渐升高，而PtoGRF15的表达水平逐渐降低。PtoTCP20激活miR396d前体基因转录，miR396d靶向PtoGRF15。PtoTCP20和miR396d促进了次生维管的发育，而PtoGRF15则延缓了次生维管的发育。
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