题目：Roles of the pepper JAZ protein CaJAZ1-03 and its interacting partner RING-type E3 ligase CaASRF1 in regulating ABA signaling and drought responses
刊名：Plant Physiology
作者：Chae Woo Lim, Sung Chul Lee et al.
单位：Chung-Ang University, Seoul, Korea
日期：11 August 2023
01
摘要
植物通过调节激素信号传导，开发了各种抵御环境胁迫的防御机制。茉莉酸（JA）是一种与植物防御反应相关的主要植物激素。JAZ蛋白在抑制JA信号传导中发挥调节作用，影响植物对生物和非生物胁迫的反应。
在这里，我们在辣椒中分离了7个JAZ基因，并根据其在非生物胁迫下的表达水平选择了一个辣椒JAZ1-03基因CA03g31030进行进一步研究。
通过病毒诱导的辣椒基因沉默（VIGS）和转基因拟南芥植株的过表达，我们确定了CaJAZ1-03的功能作用。
功能研究表明，CaJAZ1-03抑制脱落酸（ABA）信号传导和干旱胁迫反应。无细胞降解测定显示，与健康叶片相比，干旱或ABA处理的辣椒叶片中CaJAZ1-03的降解更快。相反，CaJAZ1-03在MG132处理下完全保留，表明CaJAZ103的稳定性通过泛素-26s蛋白酶体途径调节。
还发现辣椒E3连接酶CaASRF1与CaJAZ1-03相互作用并泛素化。附加的降解测定揭示了CaJAZ1-03和CaASRF1表达水平之间的负相关性。
总之，这些发现表明CaJAZ1-03负调控ABA信号传导和干旱反应，其蛋白质稳定性受CaASRF1的调节。
02
技术路线
gene cloning,bioinformatics analysis
vector construction and plant transformation
VIGS，拟南芥遗传转化
Yeast two‐hybrid assay and BiFC assay
RT‐qPCR assays
Y1H and LUC reporter assays
Bimolecular fluorescence complementation、pull-down assays、CoIP
03
主要结果
3.1 辣椒基因的分离和分子表征
JAZ家族先前的研究表明，JAZ蛋白与对几种非生物胁迫的适应性反应有关。为了分离辣椒JAZ基因，我们使用了由13个成员组成的拟南芥JAZ基因家族的氨基酸序列作为查询。基于参考辣椒基因组（C.annuum cv.CM334，1.55版）的BLASTP搜索显示，辣椒具有7个推定的JAZ基因，即CA00g07330、CA03g31030、CA06g14160、CA08g01700、CA09g17240、CA03g 35330和CA00g48500。除了CA06g14160，这些JAZ基因同时包含TIFY和Jas结构域（图1a）。
为了研究非生物胁迫是否调节这些JAZ基因的表达水平，用脱水、ABA和NaCl处理辣椒叶片，并进行qRT-PCR分析（图1b）。JAZ基因的表达水平被非生物胁迫降低或诱导，与其他基因相比，CA03g31030通过脱水和ABA表达最高。此外，JAZ基因在不同器官中差异表达（图1c）。
接下来，我们对七种CaJAZ蛋白进行了亚细胞定位测定（图2）。CaJAZ蛋白与GFP的N末端融合，并通过在烟草表皮细胞中瞬时表达。绿色荧光信号主要在细胞核中检测到。
图2 CaJAZ1蛋白的亚细胞定位。
通过农杆菌介导的侵染，用含有CaJAZ1绿色荧光蛋白（GFP）融合蛋白的构建体转化本氏烟草的叶片。
3.2 CaJAZ1‐03沉默使辣椒植株的抗旱性增强
根据表达模式，我们选择CA03g31030进行进一步研究，并将其命名为CaJAZ1‐03。为了分析CaJAZ1‐03在应激反应中的生物学功能，我们使用VIGS技术生成了CaJAZ1-敲除辣椒植株（图3）。为了评估VIGS的效率，我们用对照（TRV2:00）和CaJAZ1‐03沉默（TRV2:CaJAZ1‑03）的辣椒叶进行了RT-PCR检测，发现CaJAZ103在TRV2:Ca JAZ1−03的两个品系中的表达水平低于TRV2:00。
鉴于CaJAZ1-03是由干旱胁迫显著诱导的，我们想知道CaJAZ1‐03是否会影响辣椒植物的耐旱性。为了探索这种可能性，对TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00植物进行干旱胁迫处理，方法是停止浇水10天，然后再给植物浇水2天（图3a）。在正常和干旱处理条件下，TRV2:00和TRV2:CaJAZ1-03植物之间没有表型差异（图3a）。然而，在重新浇水后，与TRV2:00植物相比，TRV2:CaJAZ1‐03辣椒植物表现出耐受表型（图3a，右图）；TRV2:00植物的存活率（27.24%）低于TRV2:CaJAZ1‐03植物（56.34%‐64.21%）。
在处理过程中，评估了几个生理参数。我们测量了两个植物株系的叶面温度，作为气孔开度的间接指标。气孔关闭通常会导致蒸发冷却减少，从而导致叶片温度升高。在缺水后5天，与TRV2:00植物相比，TRV2:CaJAZ1‐03植物的叶片温度升高（图3b，c），这表明TRV2:Ca JAZ1‑03叶片中的气孔在干旱胁迫下相对快速地关闭。干旱胁迫导致叶绿素降解，导致叶片中叶绿素含量下降。一致的是，在缺水后8天，TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00植物叶片中的叶绿素含量降低，但TRV2:Ca JAZ1‑03的叶绿素含量高于TRV2:00（图3d）。
接下来，我们通过在8小时内每小时测量TRV2:00和TRV2:CaJAZ1-03分离叶片的鲜重来确定蒸腾水分损失（图3e）。TRV2:CaJAZ1‐03叶片的水分损失百分比低于TRV2:00叶片。在结束时间点，我们还测量了电解质泄漏和MDA含量。与TRV2:00相比，TRV2:CaJAZ1‐03叶片显示出显著较低的电解质渗漏和MDA含量（图3f，g），这表明与TRV2:00植物相比，TRV2:CaJAZ1‐03植物可能对干旱胁迫具有耐受性。
为了确认TRV2:CaJAZ1‐03植物的抗旱性增强是否与ABA敏感性有关，我们测量了有或没有ABA处理的TRV2:Ca JAZ1‑03和TRV2:00植物的叶片温度和气孔开度（图3h–j）。在没有ABA的情况下，两种植物的叶片温度没有显著差异。然而，在用ABA处理后，TRV2:CaJAZ1‐03植物表现出比TRV2:00植物更高的表面温度（图3h）。
此外，在ABA存在的情况下，CaJAZ1‐03沉默的辣椒植株的气孔孔径显著小于TRV2:00植株的气孔孔径（图3i，j），表明TRV2:CaJAZ1‑03叶片的蒸发冷却能力由于气孔孔径较小而降低。
这些数据表明，ABA敏感性的增加增强了CaJAZ1‐03沉默植物对干旱胁迫的耐受性，通过TRV介导的基因过表达系统产生的CaJAZ103过表达辣椒植物的结果进一步支持了这一点。
图3 CaJAZ1‐03沉默辣椒植株对干旱胁迫的耐受性增强。
（a） 对照（TRV2:00）和CaJAZ1‐03沉默（TRV2:CaJAZ1‑03）辣椒植株的干旱敏感性。三周龄的TRV2:CaJAZ1-03和TRV2:00辣椒植株（左）暴露于干旱胁迫下，先停止浇水10天（中），然后再重新浇水2天（右）。重新浇水2天后记录存活率。
（b，c）TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株在干旱胁迫处理后的叶片温度。在处理后5天，拍摄具有代表性的热成像图像（b），并测量叶片温度（c）。
（d） 干旱胁迫处理后8天，TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00叶片的相对叶绿素含量。
（e） TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植物叶片的蒸腾水分损失。
（f，g）TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株干燥叶片中的电解质泄漏（f）和脂质过氧化（g）。
（H） TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株暴露于ABA后的叶片温度。
（i，j）TRV2:CaJAZ1-03和TRV2:00辣椒植株中ABA诱导的气孔关闭。将果皮与0、10或20µM ABA一起孵育。拍摄代表性图像（i），并在处理后2.5小时测量每个line的气孔孔径（j）。
3.3 CaJAZ1‐03‐OX植物ABA敏感性和耐旱性降低
为了进一步研究CaJAZ1-03的生物学功能，我们产生了两个过表达CaJAZ1-03-基因的独立拟南芥转基因系（CaJAZ103-OX#2和#4）（图4）。RT-PCR分析表明，CaJAZ1-03在CaJAZ1-03-OX转基因系中高表达，但在野生型植物中不表达。
为了分析CaJAZ1‐03的过表达如何在发芽和幼苗阶段影响ABA敏感性，将野生型和CaJAZ103‐OX植物的种子接种在含有不同浓度ABA的1/2 MS培养基上（图4a–g）。在缺乏ABA的情况下，我们检测到野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物之间没有差异。然而，在存在ABA的情况下，CaJAZ1‐03‐OX植物的发芽率（图4a）和子叶绿化率（图4b，c）高于野生型植物。
此外，在发芽阶段（图4d，e）和发芽后阶段（图4f，g），CaJAZ1‐03‐OX植物的主根长度始终长于野生型植物。
这些结果表明，CaJAZ1‐03在促进种子发芽和幼苗生长方面负调控ABA信号传导。接下来，进行了干旱表型分析，以验证CaJAZ1‐03在干旱反应中的作用（图4h）。
在水分充足的条件下，野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物之间没有差异（图4h，左图）。在缺水12天和重新浇水2天后，野生型植物的枯萎程度低于CaJAZ1‐03‐OX植物（图4h，中间和右侧），尽管71.46%的野生型植物恢复了生长，但只有18.96–30.83%的CaJAZ103‐OX植株恢复了生长。
此外，还检查了野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物的蒸腾失水和叶片温度（图4i–k）。蒸腾作用测定是通过在8小时内每隔一小时测量莲座叶的鲜重来进行的。如图4i所示，野生型叶的重量高于CaJAZ1‐03‐OX叶的重量，这表明CaJAZ1‐04‐OX叶比野生型叶具有更高的蒸腾作用。叶片温度测定是通过测量野生型和CaJAZ1‐03‐OX叶片分离15分钟后的表面温度进行的。分离后，野生型和CaJAZ1‐03‐OX叶片之间没有差异。然而，15分钟后，野生型植物的叶温比CaJAZ1‐03‐OX植物的叶温度增加得更多（图4j，k）。我们的研究结果表明，CaJAZ1‐03负调控ABA介导的干旱反应。
图 4 CaJAZ1‐03过表达（OX）转基因拟南芥植物对ABA和干旱胁迫的敏感性。
（a） 野生型和转基因品系对ABA反应的种子发芽。
（b，c）野生型和转基因品系对ABA（0或0.75µM）的响应的绿子叶率。获得具有代表性的图像（b），并且在电镀后7天计算具有绿色子叶的每个品系中的幼苗数量（c）。
（d，e）CaJAZ1‐03‐OX拟南芥和野生型植物在含有0或0.75µM ABA的×0.5 MS培养基上的主根长度。
（f，g）野生型和转基因植物的发芽后生长。
（h） CaJAZ1‐03‐OX植物的干旱敏感表型。三周龄的野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物（左）暴露在干旱胁迫下，不浇水12天（中），然后再浇水2天（右）。重新浇水后2天估计存活率。
（i） 野生型和转基因植物叶片脱落后不同时间点的蒸腾水分损失。
（j，k）野生型和CaJAZ1‐03‐OX转基因植物分离后的叶片温度。在分离后15分钟拍摄代表性的热成像图像（i），并从每个line的第一片和第二片叶片测量平均叶片温度（j）。
3.4 干旱胁迫和ABA对CaJAZ1‐03稳定性的调节
几项研究表明，蛋白质稳定性和降解的微调与应激反应和ABA信号传导有关。为了检测干旱胁迫和ABA是否调节CaJAZ1‐03蛋白的稳定性，我们通过将GST‐CaJAZ103融合蛋白与用干旱或ABA处理的辣椒叶的粗提取物孵育进行了无细胞降解测定（图5a，b）。在几个时间点孵育和分析后，我们能够观察到GST‐CaJAZ1‐03融合蛋白的逐渐降解。此外，GST‐CaJAZ1‐03蛋白与经过干旱或ABA处理的辣椒植物的叶粗提取物一起孵育时，比与健康植物的提取物一起孵培育时降解更快。蛋白酶体抑制剂MG132完全抑制了CaJAZ1‐03蛋白的降解，表明CaJAZ103蛋白的稳定性受26S蛋白酶体途径的调节。
为了研究蛋白质稳定性的改变如何影响CaJAZ1‐03的定位，我们用MG132处理瞬时表达CaJAZ103‐GFP蛋白的本氏烟草的叶片（图5c）。在缺乏MG132的情况下，在细胞核中检测到GFP信号。然而，在MG132存在的情况下，CaJAZ1‐03蛋白定位在细胞质和细胞核中。
图5 CaJAZ1‐03蛋白在干旱和ABA反应中的稳定性变化。
（a，b）CaJAZ1‐03蛋白的无细胞降解测定。谷胱甘肽S转移酶（GST）标记的CaJAZ1‐03蛋白与从干旱胁迫（a）或ABA处理（b）的辣椒植物的叶片中制备的粗提取物一起孵育指定的时间段。
（c） CaJAZ1‐03‐GFP融合蛋白在含有或不含有MG132的烟草表皮细胞中的亚细胞定位。
3.5 CaJAZ1‐03与CaASRF1的相互作用
鉴于26S蛋白酶体介导的CaJAZ1-03蛋白的降解，我们进行了酵母双杂交（Y2H）筛选，以寻找CaJAZ1-03-稳定性的候选调节因子。CaJAZ1‐03被用作猎物，来自辣椒植物的已鉴定的RING‐型E3连接酶蛋白的文库被用作诱饵。
在相互作用因子中，我们重点研究了CaASRF1，它是辣椒耐旱性的正调节因子（图6a）。为了在体外支持CaJAZ1‐03和CaASRF1之间的相互作用，进行了下拉测定（图6b）。MBP‐CaASRF1和单个MBP蛋白在细菌中表达，并与谷胱甘肽S‐转移酶（GST）‐CaJAZ1‐03共培养。MBP‐CaASRF1仅被GST‐CaJAZ1‐03降低，但未被单一GST降低。
此外，还进行了LCI和BiFC测定，以研究两种蛋白质在体内的相互作用（图6c，d）。在LCI测定中，当cLUC‐CaASRF1和nLUC‐CaJAZ1‐03在本氏烟叶片中共表达时，观察到较强的LUC活性（图6c）。在BiFC测定中，我们在本氏烟和辣椒植物的细胞核中检测到黄色荧光信号（图6d）。这些结果表明，CaJAZ1‐03在体外和体内都与CaASRF1直接相互作用。
图6 CaJAZ1‐03和CaASRF1之间的物理相互作用。
（a） CaJAZ1‐03和CaASRF1的酵母双杂交分析。
（b） GST‐CaJAZ1‐03和麦芽糖结合蛋白（MBP）‐CaASRF1融合蛋白的体外下拉测定。
（c） 检测CaASRF1和CaJAZ1‐03之间相互作用的萤光素酶互补成像（LCI）测定。
（d） CaJAZ1‐03和CaASRF1的双分子荧光互补（BiFC）分析。
3.6 CaJAZ1‐03是CaASRF1的底物
接下来，进行了体外泛素化测定，以检查CaJAZ1‐03是否被CaASRF1泛素化（图7a）。基于这些数据，我们想知道CaASRF1是否会改变CaJAZ1‐03的稳定性，尤其是在应对干旱胁迫时。为了探索这一点，我们使用经过干旱胁迫处理的TRV2:CaASRF1或CaASRF1‐OX植物的叶片粗提取物进行了无细胞降解试验（图7b，c）。与用TRV2:00粗提取物孵育的蛋白质相比，用TRV2:CaASRF1叶粗提取物孵培育的CaJAZ1‐03蛋白质的降解显著减少。相反，与野生型提取物孵育相比，与CaASRF1‐OX粗提取物孵育导致CaJAZ1‐03的快速降解，表明CaASRF2可能是CaJAZ103蛋白降解的原因。
此外，我们想知道干旱胁迫如何影响植物中CaASRF1介导的CaJAZ1‐03蛋白的泛素化。为了验证这一点，我们在本氏烟植物的叶片中进行了体内泛素化测定（图7d）。
为了确保CaJAZ1‐03蛋白的表达水平一致，我们在一半叶片中表达了3xFLAG标记的CaJAZ103和GFP标记的CaASRF1，而在另一半叶片中单独表达了3xFLAG标记的CaJAZ1‐03-和GFP。这允许比较CaASRF1对同一叶片中CaJAZ1‐03的影响。通过干燥脱落的叶片来处理干旱胁迫。如图7d所示，在健康叶片中，CaASRF1的表达导致CaJAZ1‐03的泛素化，并且在干旱胁迫条件下仅表达CaJAZ103的叶片中也观察到了这种相同的泛素酸化模式。值得注意的是。干旱胁迫处理显著促进CaASRF1介导的CaJAZ1‐03的泛素化。这些结果表明，CaASRF1多泛素化CaJAZ1‐03，并通过泛素-26S蛋白酶体系统参与对干旱胁迫的降解。
图7 CaASRF1对CaJAZ1‐03蛋白稳定性的调节。
（a） CaASRF1对CaJAZ1‐03的体外泛素化。
（b，c）CaJAZ1‐03的无细胞降解测定。
（c）提取物孵育60或120分钟。
（d）干旱胁迫条件下CaASRF1对CaJAZ1‐03的体内泛素化。
04
结论
本研究表明，CaJAZ1‐03在干旱和ABA信号传导中起负调控作用，其蛋白质稳定性受RING型E3泛素连接酶CaASRF1的调节。我们的研究结果为在胁迫条件下部署的防御反应提供了关键的见解，这些发现将有助于选择对非生物胁迫具有抗性的植物。
我们的发现强调了CaJAZ1‐03和CaASRF1的激素调节可以改变辣椒植物非生物胁迫反应的潜在途径。然而，本研究尚不清楚JA信号传导中CaASRF1的其他底物靶标和ABA信号传导中的CaJAZ1‐03的其他调节因子是否存在。需要进一步的研究来阐明JA和ABA信号在非生物胁迫防御反应中的相互作用。
05
原文获取
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14692
PDF获取：
https://www.scientsgene.com/h-nd-246.html
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