题目:Roles of the pepper JAZ protein CaJAZ1-03 and its interacting partner RING-type E3 ligase CaASRF1 in regulating ABA signaling and drought responses
刊名:Plant Physiology
作者:Chae Woo Lim, Sung Chul Lee et al.
单位:Chung-Ang University, Seoul, Korea
日期:11 August 2023
01
摘要
植物通过调节激素信号传导,开发了各种抵御环境胁迫的防御机制。茉莉酸(JA)是一种与植物防御反应相关的主要植物激素。JAZ蛋白在抑制JA信号传导中发挥调节作用,影响植物对生物和非生物胁迫的反应。
在这里,我们在辣椒中分离了7个JAZ基因,并根据其在非生物胁迫下的表达水平选择了一个辣椒JAZ1-03基因CA03g31030进行进一步研究。
通过病毒诱导的辣椒基因沉默(VIGS)和转基因拟南芥植株的过表达,我们确定了CaJAZ1-03的功能作用。
功能研究表明,CaJAZ1-03抑制脱落酸(ABA)信号传导和干旱胁迫反应。无细胞降解测定显示,与健康叶片相比,干旱或ABA处理的辣椒叶片中CaJAZ1-03的降解更快。相反,CaJAZ1-03在MG132处理下完全保留,表明CaJAZ103的稳定性通过泛素-26s蛋白酶体途径调节。
还发现辣椒E3连接酶CaASRF1与CaJAZ1-03相互作用并泛素化。附加的降解测定揭示了CaJAZ1-03和CaASRF1表达水平之间的负相关性。
总之,这些发现表明CaJAZ1-03负调控ABA信号传导和干旱反应,其蛋白质稳定性受CaASRF1的调节。
02
技术路线
gene cloning,bioinformatics analysis
vector construction and plant transformation
VIGS,拟南芥遗传转化
Yeast two‐hybrid assay and BiFC assay
RT‐qPCR assays
Y1H and LUC reporter assays
Bimolecular fluorescence complementation、pull-down assays、CoIP
03
主要结果
3.1 辣椒基因的分离和分子表征
JAZ家族先前的研究表明,JAZ蛋白与对几种非生物胁迫的适应性反应有关。为了分离辣椒JAZ基因,我们使用了由13个成员组成的拟南芥JAZ基因家族的氨基酸序列作为查询。基于参考辣椒基因组(C.annuum cv.CM334,1.55版)的BLASTP搜索显示,辣椒具有7个推定的JAZ基因,即CA00g07330、CA03g31030、CA06g14160、CA08g01700、CA09g17240、CA03g 35330和CA00g48500。除了CA06g14160,这些JAZ基因同时包含TIFY和Jas结构域(图1a)。
为了研究非生物胁迫是否调节这些JAZ基因的表达水平,用脱水、ABA和NaCl处理辣椒叶片,并进行qRT-PCR分析(图1b)。JAZ基因的表达水平被非生物胁迫降低或诱导,与其他基因相比,CA03g31030通过脱水和ABA表达最高。此外,JAZ基因在不同器官中差异表达(图1c)。
接下来,我们对七种CaJAZ蛋白进行了亚细胞定位测定(图2)。CaJAZ蛋白与GFP的N末端融合,并通过在烟草表皮细胞中瞬时表达。绿色荧光信号主要在细胞核中检测到。
图2 CaJAZ1蛋白的亚细胞定位。
通过农杆菌介导的侵染,用含有CaJAZ1绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的构建体转化本氏烟草的叶片。
3.2 CaJAZ1‐03沉默使辣椒植株的抗旱性增强
根据表达模式,我们选择CA03g31030进行进一步研究,并将其命名为CaJAZ1‐03。为了分析CaJAZ1‐03在应激反应中的生物学功能,我们使用VIGS技术生成了CaJAZ1-敲除辣椒植株(图3)。为了评估VIGS的效率,我们用对照(TRV2:00)和CaJAZ1‐03沉默(TRV2:CaJAZ1‑03)的辣椒叶进行了RT-PCR检测,发现CaJAZ103在TRV2:Ca JAZ1−03的两个品系中的表达水平低于TRV2:00。
鉴于CaJAZ1-03是由干旱胁迫显著诱导的,我们想知道CaJAZ1‐03是否会影响辣椒植物的耐旱性。为了探索这种可能性,对TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00植物进行干旱胁迫处理,方法是停止浇水10天,然后再给植物浇水2天(图3a)。在正常和干旱处理条件下,TRV2:00和TRV2:CaJAZ1-03植物之间没有表型差异(图3a)。然而,在重新浇水后,与TRV2:00植物相比,TRV2:CaJAZ1‐03辣椒植物表现出耐受表型(图3a,右图);TRV2:00植物的存活率(27.24%)低于TRV2:CaJAZ1‐03植物(56.34%‐64.21%)。
在处理过程中,评估了几个生理参数。我们测量了两个植物株系的叶面温度,作为气孔开度的间接指标。气孔关闭通常会导致蒸发冷却减少,从而导致叶片温度升高。在缺水后5天,与TRV2:00植物相比,TRV2:CaJAZ1‐03植物的叶片温度升高(图3b,c),这表明TRV2:Ca JAZ1‑03叶片中的气孔在干旱胁迫下相对快速地关闭。干旱胁迫导致叶绿素降解,导致叶片中叶绿素含量下降。一致的是,在缺水后8天,TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00植物叶片中的叶绿素含量降低,但TRV2:Ca JAZ1‑03的叶绿素含量高于TRV2:00(图3d)。
接下来,我们通过在8小时内每小时测量TRV2:00和TRV2:CaJAZ1-03分离叶片的鲜重来确定蒸腾水分损失(图3e)。TRV2:CaJAZ1‐03叶片的水分损失百分比低于TRV2:00叶片。在结束时间点,我们还测量了电解质泄漏和MDA含量。与TRV2:00相比,TRV2:CaJAZ1‐03叶片显示出显著较低的电解质渗漏和MDA含量(图3f,g),这表明与TRV2:00植物相比,TRV2:CaJAZ1‐03植物可能对干旱胁迫具有耐受性。
为了确认TRV2:CaJAZ1‐03植物的抗旱性增强是否与ABA敏感性有关,我们测量了有或没有ABA处理的TRV2:Ca JAZ1‑03和TRV2:00植物的叶片温度和气孔开度(图3h–j)。在没有ABA的情况下,两种植物的叶片温度没有显著差异。然而,在用ABA处理后,TRV2:CaJAZ1‐03植物表现出比TRV2:00植物更高的表面温度(图3h)。
此外,在ABA存在的情况下,CaJAZ1‐03沉默的辣椒植株的气孔孔径显著小于TRV2:00植株的气孔孔径(图3i,j),表明TRV2:CaJAZ1‑03叶片的蒸发冷却能力由于气孔孔径较小而降低。
这些数据表明,ABA敏感性的增加增强了CaJAZ1‐03沉默植物对干旱胁迫的耐受性,通过TRV介导的基因过表达系统产生的CaJAZ103过表达辣椒植物的结果进一步支持了这一点。
图3 CaJAZ1‐03沉默辣椒植株对干旱胁迫的耐受性增强。
(a) 对照(TRV2:00)和CaJAZ1‐03沉默(TRV2:CaJAZ1‑03)辣椒植株的干旱敏感性。三周龄的TRV2:CaJAZ1-03和TRV2:00辣椒植株(左)暴露于干旱胁迫下,先停止浇水10天(中),然后再重新浇水2天(右)。重新浇水2天后记录存活率。
(b,c)TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株在干旱胁迫处理后的叶片温度。在处理后5天,拍摄具有代表性的热成像图像(b),并测量叶片温度(c)。
(d) 干旱胁迫处理后8天,TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00叶片的相对叶绿素含量。
(e) TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植物叶片的蒸腾水分损失。
(f,g)TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株干燥叶片中的电解质泄漏(f)和脂质过氧化(g)。
(H) TRV2:CaJAZ1‐03和TRV2:00辣椒植株暴露于ABA后的叶片温度。
(i,j)TRV2:CaJAZ1-03和TRV2:00辣椒植株中ABA诱导的气孔关闭。将果皮与0、10或20µM ABA一起孵育。拍摄代表性图像(i),并在处理后2.5小时测量每个line的气孔孔径(j)。
3.3 CaJAZ1‐03‐OX植物ABA敏感性和耐旱性降低
为了进一步研究CaJAZ1-03的生物学功能,我们产生了两个过表达CaJAZ1-03-基因的独立拟南芥转基因系(CaJAZ103-OX#2和#4)(图4)。RT-PCR分析表明,CaJAZ1-03在CaJAZ1-03-OX转基因系中高表达,但在野生型植物中不表达。
为了分析CaJAZ1‐03的过表达如何在发芽和幼苗阶段影响ABA敏感性,将野生型和CaJAZ103‐OX植物的种子接种在含有不同浓度ABA的1/2 MS培养基上(图4a–g)。在缺乏ABA的情况下,我们检测到野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物之间没有差异。然而,在存在ABA的情况下,CaJAZ1‐03‐OX植物的发芽率(图4a)和子叶绿化率(图4b,c)高于野生型植物。
此外,在发芽阶段(图4d,e)和发芽后阶段(图4f,g),CaJAZ1‐03‐OX植物的主根长度始终长于野生型植物。
这些结果表明,CaJAZ1‐03在促进种子发芽和幼苗生长方面负调控ABA信号传导。接下来,进行了干旱表型分析,以验证CaJAZ1‐03在干旱反应中的作用(图4h)。
在水分充足的条件下,野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物之间没有差异(图4h,左图)。在缺水12天和重新浇水2天后,野生型植物的枯萎程度低于CaJAZ1‐03‐OX植物(图4h,中间和右侧),尽管71.46%的野生型植物恢复了生长,但只有18.96–30.83%的CaJAZ103‐OX植株恢复了生长。
此外,还检查了野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物的蒸腾失水和叶片温度(图4i–k)。蒸腾作用测定是通过在8小时内每隔一小时测量莲座叶的鲜重来进行的。如图4i所示,野生型叶的重量高于CaJAZ1‐03‐OX叶的重量,这表明CaJAZ1‐04‐OX叶比野生型叶具有更高的蒸腾作用。叶片温度测定是通过测量野生型和CaJAZ1‐03‐OX叶片分离15分钟后的表面温度进行的。分离后,野生型和CaJAZ1‐03‐OX叶片之间没有差异。然而,15分钟后,野生型植物的叶温比CaJAZ1‐03‐OX植物的叶温度增加得更多(图4j,k)。我们的研究结果表明,CaJAZ1‐03负调控ABA介导的干旱反应。
图 4 CaJAZ1‐03过表达(OX)转基因拟南芥植物对ABA和干旱胁迫的敏感性。
(a) 野生型和转基因品系对ABA反应的种子发芽。
(b,c)野生型和转基因品系对ABA(0或0.75µM)的响应的绿子叶率。获得具有代表性的图像(b),并且在电镀后7天计算具有绿色子叶的每个品系中的幼苗数量(c)。
(d,e)CaJAZ1‐03‐OX拟南芥和野生型植物在含有0或0.75µM ABA的×0.5 MS培养基上的主根长度。
(f,g)野生型和转基因植物的发芽后生长。
(h) CaJAZ1‐03‐OX植物的干旱敏感表型。三周龄的野生型和CaJAZ1‐03‐OX植物(左)暴露在干旱胁迫下,不浇水12天(中),然后再浇水2天(右)。重新浇水后2天估计存活率。
(i) 野生型和转基因植物叶片脱落后不同时间点的蒸腾水分损失。
(j,k)野生型和CaJAZ1‐03‐OX转基因植物分离后的叶片温度。在分离后15分钟拍摄代表性的热成像图像(i),并从每个line的第一片和第二片叶片测量平均叶片温度(j)。
3.4 干旱胁迫和ABA对CaJAZ1‐03稳定性的调节
几项研究表明,蛋白质稳定性和降解的微调与应激反应和ABA信号传导有关。为了检测干旱胁迫和ABA是否调节CaJAZ1‐03蛋白的稳定性,我们通过将GST‐CaJAZ103融合蛋白与用干旱或ABA处理的辣椒叶的粗提取物孵育进行了无细胞降解测定(图5a,b)。在几个时间点孵育和分析后,我们能够观察到GST‐CaJAZ1‐03融合蛋白的逐渐降解。此外,GST‐CaJAZ1‐03蛋白与经过干旱或ABA处理的辣椒植物的叶粗提取物一起孵育时,比与健康植物的提取物一起孵培育时降解更快。蛋白酶体抑制剂MG132完全抑制了CaJAZ1‐03蛋白的降解,表明CaJAZ103蛋白的稳定性受26S蛋白酶体途径的调节。
为了研究蛋白质稳定性的改变如何影响CaJAZ1‐03的定位,我们用MG132处理瞬时表达CaJAZ103‐GFP蛋白的本氏烟草的叶片(图5c)。在缺乏MG132的情况下,在细胞核中检测到GFP信号。然而,在MG132存在的情况下,CaJAZ1‐03蛋白定位在细胞质和细胞核中。
图5 CaJAZ1‐03蛋白在干旱和ABA反应中的稳定性变化。
(a,b)CaJAZ1‐03蛋白的无细胞降解测定。谷胱甘肽S转移酶(GST)标记的CaJAZ1‐03蛋白与从干旱胁迫(a)或ABA处理(b)的辣椒植物的叶片中制备的粗提取物一起孵育指定的时间段。
(c) CaJAZ1‐03‐GFP融合蛋白在含有或不含有MG132的烟草表皮细胞中的亚细胞定位。
3.5 CaJAZ1‐03与CaASRF1的相互作用
鉴于26S蛋白酶体介导的CaJAZ1-03蛋白的降解,我们进行了酵母双杂交(Y2H)筛选,以寻找CaJAZ1-03-稳定性的候选调节因子。CaJAZ1‐03被用作猎物,来自辣椒植物的已鉴定的RING‐型E3连接酶蛋白的文库被用作诱饵。
在相互作用因子中,我们重点研究了CaASRF1,它是辣椒耐旱性的正调节因子(图6a)。为了在体外支持CaJAZ1‐03和CaASRF1之间的相互作用,进行了下拉测定(图6b)。MBP‐CaASRF1和单个MBP蛋白在细菌中表达,并与谷胱甘肽S‐转移酶(GST)‐CaJAZ1‐03共培养。MBP‐CaASRF1仅被GST‐CaJAZ1‐03降低,但未被单一GST降低。
此外,还进行了LCI和BiFC测定,以研究两种蛋白质在体内的相互作用(图6c,d)。在LCI测定中,当cLUC‐CaASRF1和nLUC‐CaJAZ1‐03在本氏烟叶片中共表达时,观察到较强的LUC活性(图6c)。在BiFC测定中,我们在本氏烟和辣椒植物的细胞核中检测到黄色荧光信号(图6d)。这些结果表明,CaJAZ1‐03在体外和体内都与CaASRF1直接相互作用。
图6 CaJAZ1‐03和CaASRF1之间的物理相互作用。
(a) CaJAZ1‐03和CaASRF1的酵母双杂交分析。
(b) GST‐CaJAZ1‐03和麦芽糖结合蛋白(MBP)‐CaASRF1融合蛋白的体外下拉测定。
(c) 检测CaASRF1和CaJAZ1‐03之间相互作用的萤光素酶互补成像(LCI)测定。
(d) CaJAZ1‐03和CaASRF1的双分子荧光互补(BiFC)分析。
3.6 CaJAZ1‐03是CaASRF1的底物
接下来,进行了体外泛素化测定,以检查CaJAZ1‐03是否被CaASRF1泛素化(图7a)。基于这些数据,我们想知道CaASRF1是否会改变CaJAZ1‐03的稳定性,尤其是在应对干旱胁迫时。为了探索这一点,我们使用经过干旱胁迫处理的TRV2:CaASRF1或CaASRF1‐OX植物的叶片粗提取物进行了无细胞降解试验(图7b,c)。与用TRV2:00粗提取物孵育的蛋白质相比,用TRV2:CaASRF1叶粗提取物孵培育的CaJAZ1‐03蛋白质的降解显著减少。相反,与野生型提取物孵育相比,与CaASRF1‐OX粗提取物孵育导致CaJAZ1‐03的快速降解,表明CaASRF2可能是CaJAZ103蛋白降解的原因。
此外,我们想知道干旱胁迫如何影响植物中CaASRF1介导的CaJAZ1‐03蛋白的泛素化。为了验证这一点,我们在本氏烟植物的叶片中进行了体内泛素化测定(图7d)。
为了确保CaJAZ1‐03蛋白的表达水平一致,我们在一半叶片中表达了3xFLAG标记的CaJAZ103和GFP标记的CaASRF1,而在另一半叶片中单独表达了3xFLAG标记的CaJAZ1‐03-和GFP。这允许比较CaASRF1对同一叶片中CaJAZ1‐03的影响。通过干燥脱落的叶片来处理干旱胁迫。如图7d所示,在健康叶片中,CaASRF1的表达导致CaJAZ1‐03的泛素化,并且在干旱胁迫条件下仅表达CaJAZ103的叶片中也观察到了这种相同的泛素酸化模式。值得注意的是。干旱胁迫处理显著促进CaASRF1介导的CaJAZ1‐03的泛素化。这些结果表明,CaASRF1多泛素化CaJAZ1‐03,并通过泛素-26S蛋白酶体系统参与对干旱胁迫的降解。
图7 CaASRF1对CaJAZ1‐03蛋白稳定性的调节。
(a) CaASRF1对CaJAZ1‐03的体外泛素化。
(b,c)CaJAZ1‐03的无细胞降解测定。
(c)提取物孵育60或120分钟。
(d)干旱胁迫条件下CaASRF1对CaJAZ1‐03的体内泛素化。
04
结论
本研究表明,CaJAZ1‐03在干旱和ABA信号传导中起负调控作用,其蛋白质稳定性受RING型E3泛素连接酶CaASRF1的调节。我们的研究结果为在胁迫条件下部署的防御反应提供了关键的见解,这些发现将有助于选择对非生物胁迫具有抗性的植物。
我们的发现强调了CaJAZ1‐03和CaASRF1的激素调节可以改变辣椒植物非生物胁迫反应的潜在途径。然而,本研究尚不清楚JA信号传导中CaASRF1的其他底物靶标和ABA信号传导中的CaJAZ1‐03的其他调节因子是否存在。需要进一步的研究来阐明JA和ABA信号在非生物胁迫防御反应中的相互作用。
05
原文获取
原文链接:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pce.14692
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