题目：IbMYB73 targets abscisic acid-responsive IbGER5 to regulate root growth and stress tolerance in sweet potato
刊名：Plant Physiology
作者：Shao-zhen He, Huan Zhanget al.
单位：Sanya Institute of China Agricultural University, Sanya
日期：10 October 2023
01
摘要
根系发育影响植物对环境条件的反应，而发育良好的根系提高了植物在非生物胁迫下的存活率。然而，植物根系发育和非生物胁迫耐受性的分子和遗传机制尚不清楚。
在本研究中，我们通过cDNA AFLP和RNA-seq分析鉴定了MYB转录因子编码基因IbMYB73。在非生物胁迫下，IbMYB73在耐盐甘薯（Ipomoea batatas）系ND98根系中的表达受到极大抑制，ABA、NaCl和甘露醇处理显著降低了其在根系中的启动子活性。
IbMYB73的过表达显著抑制不定根生长和非生物胁迫耐受性，而IbMYB73RNAi植物表现出相反的模式。IbMYB73影响参与ABA途径的基因的转录。此外，IbMYB73形成同源二聚体，并通过与启动子中的MBSI基序结合来激活脱落酸应答蛋白IbGER5的转录。IbGER5过表达显著抑制不定根生长和非生物胁迫耐受性，同时降低ABA含量，而IbGER5 RNAi植物表现出相反的效果。
我们的研究结果表明，IbMYB73-IbGER5模块调节甘薯ABA依赖性不定根生长和非生物胁迫耐受性，为培育具有良好的根系介导的非生物胁迫耐性的优良作物品种提供了候选基因。
02
技术路线
salt-tolerant sweet potato (Ipomoea batatas) line 'ND98’, the salt-sensitive sweet potato variety 'Lizixiang
DNA sequencing and analysis
Promoter expression analysis
Transgenic plant generation
Pull-down assay、Y2H assay、BiFC assay
Luciferase complementation assay、GDP-L-galactose phosphorylase assays
Abiotic stress tolerance assays
03
主要结果
3.1 IbMYB73参与ABA依赖性非生物胁迫反应
为了确定红薯根中潜在的非生物胁迫反应因子，我们选择了在红薯根中高表达并对各种非生物胁迫有反应的基因。与其他各种组织相比，发现一种转录因子基因IbMYB73在根中高度表达。我们先前生成的RNA-seq数据显示，在盐胁迫下，IbMYB73在耐盐甘薯品系ND98和耐盐品种lizixiang中差异表达。因此，鉴于IbMYB73在甘薯根系非生物胁迫反应中的潜在作用，我们将重点放在了它上。我们进行了RT-qPCR，以检测不同胁迫条件下ND98和lizixiang植物不定根中IbMYB73的相对转录水平。在NaCl、PEG和ABA处理后，IbMYB73的表达在ND98植物中被抑制5.53倍（12小时）、2.37倍（12 h）和2.11-倍（12 h），但在lizixiang植物中分别被诱导1.32倍（2小时）、4.84倍（2 h）和5.21倍（6 h）（图1，A–C）。
此外，IbMYB73在2个月大的田间生长的ND98植物的须根中高度表达（图1D）。IbMYB73的867bp开放阅读框（ORF）编码288个氨基酸的蛋白质，预测分子量为31.4kDa。IbMYB73含有保守的R2和R3 MYB结构域重复序列，是R2R3-MYB转录因子家族第22亚组的特征（图1E）。IbMYB73显示出与拟南芥AtMYB73更高的序列相似性（图1F）。IbMYB73的基因组序列仅包含一个外显子，与AtMYB73相似（图1G）。ND98和lizixiang的IbMYB73启动子区都含有两个ABA响应元件（图1H）。值得注意的是，在lizixiang的IbMYB73启动子区（起始位点上游约668 bp）检测到142bp的缺失，而ND98中不存在这种缺失。
为了进一步研究142bp的变异是否影响IbMYB73的激活，我们在红薯组织中分别表达了两种类型的IbMYB7启动子。组织化学染色和GUS表达结果显示，lizixiang的IbMYB73启动子驱动的GUS活性和GUS蛋白表达显著高于ND98的IbMYB73启动子驱动。
我们进一步生成了由IbMYB73启动子驱动的GUS的转基因拟南芥植物，并发现通过组织化学染色评估，所有组织都表现出GUS活性；然而，RT-qPCR分析显示，在ABA、NaCl或甘露醇处理后，GUS在根中的表达受到显著抑制（图1、I和J）。总之，这些结果表明IbMYB73参与了甘薯的非生物胁迫反应。
3.2 IbMYB73是一种细胞核定位的反式激活因子
为了鉴定IbMYB73的亚细胞定位，我们在红薯原生质体中瞬时表达了IbMYB73-GFP融合蛋白。共聚焦显微镜显示IbMYB73-GFP定位于细胞核，而单独的GFP（对照）定位在整个胞质溶胶中（图1K）。我们接下来在酵母单杂交分析中使用全长IbMYB73或蛋白质的两个片段（174个C末端氨基酸残基[IbMYB73C173]和115个N末端氨基酸残基[IbMYB73N115]）测试IbMYB73的反式激活活性。我们发现IbMYB73C173是转录激活所必需的（图1L）。然后将IbMYB73的全长和两个片段分别进一步融合到GAL4的DNA结合结构域，并在原生质体中瞬时转染。全长IbMYB73和IbMYB73C173显示出比IbMYB73N115明显更强的反式激活活性（图1M）。这些观察结果证实了IbMYB73是一种细胞核定位的反式激活因子，其C末端是其反式激活活性所必需的。
3.3 IbMYB73抑制甘薯不定根生长及对非生物胁迫的耐受性
为了研究IbMYB73在甘薯中的潜在生物学功能，我们通过根癌农杆菌介导的转化，产生了盐敏感甘薯品种lizixiang的三个IbMYB73-过表达系（OE-M7、OE-M9和OE-M11）和四个IbMYB73-RNAi系（Ri-M1-Ri-M4）。
在田间生长四个月后，根的数量没有显著差异，而IbMYB73 OE系的根重量减少。然后，我们比较了体外生长的耐盐ND98、WT和IbMYB73转基因植物的根系形态（图2A）。在正常条件下，IbMYB73 OE系比WT形成更少的不定根，而ND98和两个IbMYB73RNAi系则相反（图2B）。在ABA处理下，与WT相比，IbMYB73 OE系形成的不定根明显更多，而ND98和IbMYB73RNAi系形成的根明显更少（图2B），表明IbMYB7 3影响甘薯的ABA敏感性。在NaCl和PEG处理下，与野生型相比，IbMYB73 OE系中不定根的数量、长度和重量显著减少，而在ND98和IbMYB73RNAi系中观察到相反的情况（图2，B–D）。这些发现表明，IbMYB73参与了根介导的非生物胁迫敏感性。
我们进一步观察了2个月大的田间种植植物的根系生长情况（图2E）。与观察到的体外生长根系的生长一致，在ABA处理下，与野生型相比，IbMYB73 OE系的不定根数量增加，而IbMYB73-RNAi系的不定根数量显著减少（图2F）。在正常条件下以及在NaCl或PEG处理下，与WT对照相比，IbMYB73 OE系形成的不定根明显较少，而IbMYB73RNAi系形成的则明显较多（图2F）。同时，在NaCl和PEG处理下，与WT相比，IbMYB73 OE系的不定根长度和重量都有所减少；相反，IbMYB73 RNAi系的那些增加（图2，G和H）。这些结果表明，IbMYB73抑制了甘薯ABA依赖性不定根的生长和对非生物胁迫的耐受性。
图2:IbMYB73的过表达抑制不定根生长，降低ABA敏感性和非生物胁迫耐受性。
A–D，耐盐系ND98、lizixiang（WT）和IbMYB73转基因红薯植株在正常条件下在MS培养基上生长或在ABA（1μM）、NaCl（150 mM）或PEG6000（20%）下生长10天的响应和不定根生长条件。
E–H，在Hoagland溶液中单独（正常）或添加ABA（1μM）、NaCl（150 mM）或PEG6000（20%）水培10天的2个月大的田间生长的IbMYB73转基因和WT红薯植株的响应和不定根生长条件。
为了进一步评估IbMYB73在非生物胁迫中的作用，我们在移植箱中种植转基因和野生型植物，并使所有植物受到盐（200mM NaCl）和干旱胁迫。我们发现，与野生型相比，在正常条件下，IbMYB73 OE系的生长和生根减少（图3A）。在盐和干旱胁迫下，与野生型植物相比，IbMYB73 OE系变成棕色，并且表现出明显较差的生根；相反，IbMYB73 RNAi系表现出更好的生长和生根以及更大的鲜重和干重（图3，A和B）。
此外，我们在温室中种植了IbMYB73转基因和WT植物，并对它们进行干旱胁迫（两个月内不浇水）。我们观察到，大多数IbMYB73 OE植物比WT植物表现出生根困难、变褐和早死；相反，IbMYB73 RNAi系显示出更多的不定根和增加的鲜重和干重（图3，C和D）。众所周知，盐和干旱胁迫会诱导植物的氧化损伤。在这里，我们发现，在盐和干旱胁迫下，IbMYB73 OE系的不定根中H2O2和MDA含量高于野生型植物，而脯氨酸含量较低。相反，IbMYB73 RNAi系在各自的生理指标上表现出相反的模式（图3，E–G）。
在正常条件下以及在NaCl和PEG处理下，与野生型植物相比，IbMYB73 OE系不定根中的ABA含量显著降低，而在IbMYB73RNAi系中则相反（图3H）。总之，我们的数据表明，IbMYB73的过表达抑制了甘薯ABA依赖性不定根的生长，并降低了其对非生物胁迫的耐受性
图3。IbMYB73的过表达对土壤条件下的非生物胁迫耐受性具有负调控作用。
A和B，在正常条件下在移植箱中生长或在4或6周期间经受200mM NaCl或干旱胁迫的2个月大的田间生长的IbMYB73 OE、IbMYB73RNAi和WT红薯植物（用白色虚线分隔）的响应。
C和D，2个月大的田间生长的IbMYB73过表达和WT红薯植物（用黑色虚线分隔）在温室中生长8周而不浇水的反应。OE-M、IbMYB73过表达系。Ri-M、IbMYB73 RNAi系。在正常条件下以及在150 mM NaCl和20%PEG6000处理10天的MS培养基上生长的IbMYB73转基因和WT植物的不定根中的E–H、H2O2含量（E）、MDA含量（F）、脯氨酸含量（G）和ABA含量（H）。
3.4 IbMYB73调节ABA途径相关基因的转录
由于我们发现IbMYB73参与ABA介导的不定根生长和非生物胁迫反应，我们接下来确定了转基因植物不定根中参与ABA生物合成和信号传导的关键基因的表达水平。
在ABA处理下，与WT相比，ABA生物合成相关基因IbNCED3、IbABA2和IbAAO3；ABA信号传导相关基因IbABI2和IbSnRK2.3；以及非生物胁迫耐受相关基因IbDREB1D、IbRD22和IbRD26在IbMYB73 OE植物中显著下调，但在IbMYB73 RNAi植物中显著上调（图4，A-H）。然而，与野生型植物相比，ABA应答基因IbGER5的表达在IbMYB73 OE植物中显著上调，但在IbMYB73 RNAi植物中显著下调（图4I）。这些数据表明，IbMYB73通过影响ABA途径相关基因的转录来调节甘薯的非生物胁迫耐受性。
图4。IbMYB73在有或没有ABA处理的情况下调节参与ABA途径的基因的转录。
A–I，IbNCED3（A）、IbABA2（B）、IbAAO3（C）、IbABI2（D）、IbSnRK2.3（E）、IbDERB1D（F）、IbRD22（G）、IbRD26（H）和IbGER5（I）在正常条件下生长在MS培养基上的IbMYB73 OE和IbMYB73RNAi以及WT植物的不定根中的相对表达水平
3.5 IbMYB73形成同源二聚体并激活ABA应答基因IbGER5的转录
为了更好地了解IbMYB73介导的不定根生长和非生物胁迫反应的调控机制，我们使用IbMYB73N115片段作为诱饵来筛选红薯Y2H文库。值得注意的是，我们发现IbMYB73与自身强烈相互作用，形成同源二聚体（图5A）。我们使用BiFC和Co-IP分析进一步验证了这一点，结果显示IbMYB73确实在植物细胞的细胞核中形成了同源二聚体（图5、B和C）。在植物中，MYB蛋白在其靶基因的启动子中与MBSI和MBSII基序结合。此外，在红薯中，与转录起始位点相邻的结合位点更有可能被转录因子结合和调节。因为我们发现ABA响应基因IbGER5在不同胁迫条件下的IbMYB73 OE植物中显著上调，而在IbMYB73RNAi植物中下调，我们研究了MBSI和MBSII基序是否存在于IbGER5的启动子区，并在−214bp处鉴定了MBSI基序（图5D）。
我们进一步对OE-M11系的不定根进行了ChIP-qPCR，并观察到IbMYB73在体内直接靶向IbGER5（图5D）。然后，我们基于积累的IbMYB73蛋白丰度和竞争性探针进行EMSA。添加两倍量的IbMYB73显著增加了其与IbGER5结合的能力（图5E）。同时，竞争性探针的积累逐渐消除了IbMYB73与IbGER5启动子探针的结合（图5E）。
进一步的瞬时双荧光素酶报告基因测定显示，在正常条件下和ABA处理后，IbMYB73直接激活了IbGER5启动子，并且使IbMYB7蛋白的量加倍显著增强了IbGER 5启动子的激活（图5F）。这些结果表明，IbMYB73在红薯中形成同源二聚体，并激活ABA响应基因IbGER5的转录。GER在植物中很少有特征。我们在甘薯（Ipomoea batatas，2n=6x=90）及其两个二倍体亲属Ipomoea triloba（2n=2x=30）和Ipomoea trofida（2n=2y=30）中分别鉴定了12、9和9个GER（图5G）。
此外，在拟南芥、水稻、玉米和小麦中分别鉴定出9、9、14和27个GER（图5G；补充表S4）。根据它们的系统发育关系，这些GER可以分为六个亚组（图5G）。IbGER5的852bp ORF编码283个氨基酸的蛋白质，预测分子量为31.32kDa。IbGER5蛋白仅包含一个保守的GRAM结构域，并且显示出与AtGER5更高的序列相似性。与AtGER5一样，IbGER5的基因组序列包含三个外显子和两个内含子。IbGER5的启动子含有一个ABA响应元件。RT-qPCR分析显示，IbGER5在2个月大的田间生长的ND98植物的贮藏根中高度表达（图5H）。在NaCl、PEG和ABA处理下，IbGER5的表达在ND98系中被抑制了几乎2.11倍（在12小时）、4.86倍（在12h）和2.99倍（在2h），但在栗子香植物中分别被诱导了2.40倍（在6h）、7.65倍（在4h）和6.44倍（在8h）（图5I）。亚细胞定位分析显示，IbGER5定位在原生质体的质膜上（图5J）。总之，这些结果表明，IbMYB73可能通过IbGER5介导的ABA依赖性反应调节红薯的不定根生长和非生物胁迫敏感性
图5。IbMYB73形成同源二聚体并激活ABA-应答基因IbGER5的转录。
A、 Y2H分析显示IbMYB73与自身相互作用。将酵母细胞种植在含有20 mg/L X-α-gal培养基的SD/−Trp/−Leu和SD/−Trp/−Leu/−Ade/−His上，以筛选可能的相互作用。BD-53用作阳性对照，而BD-Lam用作阴性对照。
B、 BiFC分析表明，IbMYB73在本氏叶表皮细胞中与自身相互作用。使用来自MYB转录因子家族的IbMYB308L作为阴性对照的相关非相互作用蛋白。
C、 Co-IP分析表明，IbMYB73在体内与自身相互作用。使用IbMYB308L作为阴性对照的相关非相互作用蛋白。
D、 使用35S:IbMYB73-GFP和35S:GFP植物与抗GFP抗体的ChIP-qPCR分析表明，IbMYB73可以直接与IbGER5启动子结合。
E，EMSA显示IbMYB73可以通过与MBSI基序结合直接靶向IbGER5。
F、 双LUC分析表明，IbMYB73在正常条件下和ABA处理后激活了IbGER5启动子。
3.6 IbGER5抑制ABA依赖性不定根生长和非生物胁迫耐受
为了研究IbGER5在红薯中的潜在生物学功能，我们通过农杆菌介导的转化，从对盐敏感的红薯品种栗子香的细胞聚集体中产生了三个IbGER5过表达系（OE-G1、OE-G2和OE-G4）和两个IbGER5RNAi系（Ri-G6和Ri-G7）。在田间生长四个月后，与野生型植物相比，IbGER5 OE植物表现出储存根重减少，而IbGER5 RNAi植物表现出更多更重的块根。
然后，我们研究了体外生长的IbGER5转基因植物的形态变化（图6A；）。在正常条件下以及在NaCl或PEG处理下，与野生型植物相比，IbGER5 OE系形成较少的不定根，而IbGER5 RNAi系形成较多的不定根。在ABA处理下，与野生型植物相比，IbGER5 OE植物形成的不定根明显更多，而IbGER5 RNAi系形成的不定根明显更少（图6，B–D）。
接下来，我们在添加或不添加1μM ABA、150 mM NaCl或20%（w/v）PEG6000的Hoagland溶液中培养田间生长的植物（图6E）。在ABA处理下，与野生型植物相比，IbGER5 OE系显示出显著更多的不定根数量，与IbGER5 RNAi植物的记录相反（图6F）。在正常条件下以及在NaCl或PEG处理下，与野生型植物相比，IbGER5 OE系表现出减少的生根和重量，而IbGER5 RNAi系形成了明显更多的不定根（图6，F–H）。
图6。IbGER5的过表达抑制不定根生长，降低ABA敏感性和非生物胁迫耐受性。
A–D，在正常条件下在MS培养基上生长或在ABA（1μM）、NaCl（150 mM）或PEG6000（20%）下生长10天的IbGER5转基因和栗子香（WT）红薯植株的响应和不定根生长条件。
E–H，在单独（正常）或添加ABA（1μM）、NaCl（150 mM）或PEG6000（20%）的Hoagland溶液中水培10天的2个月大的田间生长的IbGER5转基因和WT红薯植株的响应和不定根生长条件。
为了进一步评估IbGER5在土壤非生物胁迫下的作用，我们在移植箱或温室中种植了IbGER5转基因和WT植物。在正常条件下以及在盐或干旱胁迫下，移植箱中生长的IbGER5 OE系表现出比WT植物更差的生根，而IbGER5 RNAi系表现出更好的生长和生根（图7，A和B）。在温室中，大多数IbGER5 OE植物难以生根，变成棕色并死亡；然而，IbGER5 RNAi系显示出比野生型植物更好的生长和生根（图7，C和D）。
我们进一步发现，与野生型植物相比，IbGER5 OE系的H2O2和MDA含量更高，而脯氨酸和ABA含量更低；然而，在IbGER5 RNAi植物中观察到了相反的效果（图7，E–H）。此外，ABA信号传导相关基因IbABI2和IbSnRK2.3在IbGER5 OE植物中显著下调，但在不同胁迫条件下的IbGER5 RNAi植物中显著上调。总之，这些结果表明，IbGER5抑制ABA依赖性不定根的生长，并在甘薯的非生物胁迫耐受中发挥负调控作用。
为了进一步研究IbMYB73-IbGER5模块在甘薯中的调控机制，我们在IbGER5 RNAi系（Ri-G6）中过表达了IbMYB73，并检测了正常、ABA、NaCl和PEG处理下的不定根生长条件。结果表明，IbMYB73/Ri-G6植物不定根的数量、长度和重量与野生型相似，表明IbMYB73通过IbGER5调节不定根生长和非生物胁迫耐受性（图7，I–L）。总之，我们的数据表明，在非生物胁迫下，IbMYB73-IbGER5模块调节ABA依赖性不定根的生长，降低甘薯对非生物胁迫的耐受性
图7。IbGER5的过度表达对土壤条件下的非生物胁迫耐受性具有负调控作用。
04
结论
在这项研究中，我们发现MYB转录因子IbMYB73形成同源二聚体，并与ABA反应基因IbGER5的启动子结合以激活其转录。我们进一步发现，IbMYB73和IbGER5的过表达通过抑制ABA信号传导显著抑制不定根生长和非生物胁迫耐受性。总之，我们的数据为MYB转录因子在调节植物ABA依赖性根系生长和非生物胁迫耐受中的作用提供了见解。
本研究的结果揭示了IbMYB73-IbGER5模块在调节甘薯ABA依赖性不定根生长和非生物胁迫耐受性中的作用的调控机制。也就是说，我们发现IbMYB73形成同源二聚体，并与IbGER5的启动子结合以激活其转录。对于未来的种质改良，抑制IbMYB73和IbGER5在非生物胁迫敏感种质中的表达可能会激活ABA反应，从而促进根系发育，提高甘薯植物的产量和非生物胁迫耐受性
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原文获取
原文链接：
https://doi.org/10.1093/plphys/kiad532
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https://www.scientsgene.com/h-nd-265.html
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