题目：Alcohol dehydrogenases regulated by a MYB44 transcription factor underlie Lauraceae citral biosynthesis
刊名：Plant Physiology
作者：Yunxiao Zhao and Yangdong Wang et al.
单位：Chinese Academy of Forestry, Beijing
日期：13 October 2023
01
摘要
特定萜烯类化合物在陆地植物进化中的出现，以及它们在植物与环境相互作用中的作用。特别关注了樟科植物，它们由于含有单萜烯化合物而在生态和经济上具有重要价值。
然而，尚未明确单萜烯生物合成的基因簇。研究揭示了一个特定于樟科的柠檬醛生物合成基因簇，其中包括了调控因子MYB44以及两种修饰酶醇脱氢酶（ADHs）。
此外，研究发现MYB44通过直接结合特定基因的启动子来负调控柠檬醛的生物合成。这些发现为我们提供了有关植物萜烯类物质生物合成进化及其调控机制的重要见解。
02
技术路线
使用系统发育、共线性和生化分析来鉴定和研究Lauraceae特异性柠檬醛生物合成基因群（CGC）
从山椒不同发育阶段的水果中提取了总RNA，进行了RNA提取和逆转录
对月桂科物种的基因组进行了比较和功能分析，以确定TPS基因在该家族萜类生物合成中的作用
确定了 lcadHS 和 lcMyb44 蛋白的亚细胞定位。
从中国杭州市富阳区的农田中采集了山椒（Litsea cubeba）样本
ChIP-qPCR assay、Yeast two-hybrid assay、BiFC assay
Construction and transformation of mountain pepper
03
主要结果
3.1 鉴定柠檬醛生物合成基因簇：
发现了一种特定于桂科植物的柠檬醛生物合成基因簇，由MYB44调控，涉及两种ADH酶（LcADH28和LcADH29）作为修饰酶。该基因簇在桂科家族内存在分化。
3.2 ADH（醛酮还原酶）基因簇的进化和分歧情况
首先，作者指出了樟树、粗樟树和山胡椒属于樟科中的一个分支，该分支在樟科中的进化速度最快，同时富含单萜化合物（单萜类化合物是一类重要的植物次生代谢产物）。
为了研究CGC（柠檬醛合酶基因簇）的起源和进化，作者选择了樟树、粗樟树、山胡椒、玉米（Zea mays）和葡萄（Vitis vinifera）的基因组进行进一步的分析。通过比较这五个物种中CGC所在的共线基因区域，作者展示了这些区域的情况（见图2A）。
为了鉴定MYB44、MRG1、LcADH28和LcADH29的可能同源基因，作者比对了包含前五位同源基因的基因组片段，并将各个匹配基因以共线线的形式绘制出来。然而，在玉米和葡萄中并没有检测到ADH28的同源基因，尽管在玉米中存在一个ADH29的同源基因（见图2B和附图S2）。
对ADH基因的重复模式和系统发育分析表明，ADH29经历了独立的进化，而ADH28是在樟科家族内部的近距离重复产生的。实际上，序列比对显示，LcADH28和LcADH29的序列相似度为66.86%。
在粗樟树中，CkADH29被注释为一个假基因，其ADH_N结构域和ADH_zinc_N结构域均不完整。这些结果同样提示ADH29经历了独立的进化，而ADH28可能是在樟科物种中的重复后保留下来的。
3.3 ADH28和ADH29的同源基因在酶活性和底物特异性方面的差异。
研究发现樟树的叶子和山胡椒的果实中含有大量的柠檬醛，而粗樟树中的柠檬醛尚未有报道。
为了了解参与柠檬醛合成的基因，研究人员从三种樟科物种中克隆和表达了ADH28和ADH29的同源基因，并在大肠杆菌中检测到了重组蛋白。
实验结果显示，三种ADH28的同源基因在底物选择上相似，但在酶活性上有差异。LcADH28对香茅醇和肉草醇的催化作用较强，而CkADH28的活性较低，而且对肉草醇的催化活性几乎可以忽略。CkADH28在这方面的酶活性最低。
相比之下，LcADH29对肉草醇的活性高于对香茅醇的活性。然而，CcADH29没有显示出酶活性，作者猜测这可能是由于其活性位点的变异，其底物可能是其他醇类物质。
为了量化在樟科中ADH28和ADH29的功能差异，作者进行了酶动力学分析。结果显示，这两者在对香茅醇和肉草醇的酶动力学参数上存在显著差异。
3.4 在山胡椒植物中过表达LcADH28和LcADH29基因增强柠檬醛的生物合成
通过在山胡椒叶片中瞬时过表达LcADH28和LcADH29基因，研究人员成功地使这两个基因的表达水平显著增加（分别增加了大约5.4倍和7.3倍），与对照组相比（见图5A）。
在LcADH28基因渗透后，叶片中geranial和neral的含量显著增加，分别为11.54 μg g–1和4.11 μg g–1，而对照组中分别为5.50和2.74 μg g–1（见图5B）。
过表达LcADH29导致geranial（9.56 μg g–1）和neral（4.90 μg g–1）产量显著增加，分别增加了1.8倍和1.7倍（见图5B）。
与酶活性分析的结果一致，LcADH28显示出对香茅醇更强的偏好，而LcADH29则对肉草醇的偏好更强。
这些发现表明，引入LcADH28或LcADH29可以在体内和体外使用香茅醇和肉草醇作为底物，从而增加柠檬醛的生物合成。
研究人员还成功地创建了稳定过表达LcADH28或LcADH29的转基因山胡椒株系。通过GFP荧光、PCR和Southern印迹等方法筛选出阳性转基因株系，并选取了表达最高的LcADH28-OE-1、4和6以及LcADH29-OE-2、5和8用于后续实验。
实验证明，在转基因山胡椒愈伤组织中，geranial的浓度显著增加。LcADH28-OE株系的geranial浓度分别为0.087 μg g–1、0.051 μg g–1和0.025 μg g–1，而对照组中未检测到geranial。在LcADH29-OE株系中，geranial浓度分别为0.027 μg g–1、0.016 μg g–1和0.015 μg g–1。LcADH28和LcADH29的过表达并不影响neral的生物合成。
总的来说，这些结果表明，在山胡椒中，LcADH28和LcADH29编码了负责柠檬醛生物合成的ADH酶。
图5 LcADH在体内催化柠檬醛的生物合成。
A) 在山胡椒的叶片中进行了LcADH28和LcADH29的瞬时过表达实验。在渗透后，植株生长了2天，并确认了LcADH28和LcADH29的表达水平。
B) LcADH28和LcADH29的过表达显著增加了柠檬醛的浓度。使用气相色谱质谱联用（GC-MS）进行了分析。
C) 显示了转基因山胡椒株系中LcADH28的表型。
D) 显示了转基因山胡椒株系中LcADH29的表型。
E) 显示了转基因山胡椒株系中LcADH28的表达水平。
F) 显示了转基因山胡椒株系中LcADH29的表达水平。
G) 和 H) 显示了转基因山胡椒愈伤组织中柠檬醛的含量。
3.5 LcMYB44通过直接结合到LcADH28和LcADH29的启动子区域中的特定DNA序列，抑制了它们的转录。
LcMYB44属于亚群22，具有一个N端的R2R3-MYB结构域和两个特征性的结构单元，这在之前的研究中已有报道。植物中，MYB通过结合到启动子中的MYB核心、MBS以及其他MYB识别元件（MREs），来调控次生代谢物质的生物合成。
通过对CGC基因启动子序列进行筛选，发现了多个MREs，包括C/TAACT/AG，AACCTAA和CCGTGG元素。
为了确定LcMYB44调控LcADH28和LcADH29表达的机制，进行了双荧光素酶报告基因实验。实验结果表明，LcMYB44抑制了LcADH28和LcADH29的表达，尤其是对只含有两个MREs的LcADH28的抑制作用更强。
进一步的实验通过酵母单杂交（Y1H）实验探究了LcMYB44与LcADH28和LcADH29启动子中MREs的结合情况。实验结果显示，LcMYB44能够与CAGTTG和AACCTAA元素结合。
电泳迁移位实验证实了LcMYB44蛋白与包含MREs的LcADH28和LcADH29启动子片段之间的结合。结果显示，LcMYB44可以识别并结合LcADH28启动子中的CAGTTG和AACCTAA元素，以及LcADH29启动子中的CAGTTG元素。
综上所述，LcMYB44通过直接结合到LcADH28和LcADH29启动子区域中的CAGTTG和AACCTAA元素，抑制了它们的转录。
图6. LcMYB44结合到LcADH28和LcADH29的启动子区域并抑制它们的表达。
A) LcMYB44蛋白序列的最大似然树，包括LcMYB44。
B) 柠檬醛生物合成基因簇（CGC）中的MYB识别元件（MREs）。
C) 双荧光素酶报告基因实验。显示了在实验中使用的效应子（pGreenII 62-SK-LcMYB44）和报告子（35S:REN-proLcADH28-LUC、35S:REN-proLcADH29-LUC、35S:REN-proLcMRG1-LUC）的构建图示。相对荧光素（LUC）活性被归一化到参考Renilla（REN）荧光素的活性。与对照相比，LcMYB44显著抑制了LcADH28和LcADH29的表达。
D) 和 E) 基于酵母单杂交（Y1H）实验，显示了LcMYB44结合到LcADH28和LcADH29启动子的M5（CAGTTG）和M6（TTAGGTTT）区域。使用了三次重复的MREs作为诱饵（pAbAi-3´MRE）。
F) 探针：M5和M6代表了LcADH28和LcADH29启动子区域。
G) 显示了LcMYB44与LcADH28和LcADH29启动子的相互作用。使用了His-LcMYB44融合蛋白和标记的探针。第1-5条带含有M5或M6探针，第6和第7条带含有突变探针。未标记的探针用作竞争剂。
3.6 山胡椒中LcMYB44基因的调控作用
使用VIGS方法抑制了LcMYB44基因在山胡椒中的表达。在注射TRV-LcMYB44载体后的十五天内，对植株的生长状态和萜烯类物质的积累进行了检查。
实验结果显示，山胡椒幼苗的生长正常，与对照组相比，这些幼苗中LcMYB44的表达水平降低。这种LcMYB44表达水平的降低伴随着LcADH28和LcADH29表达水平的显著上调（见图7A和图7B）。
此外，在这些幼苗中，柠檬醛和其他萜烯类物质的积累显著增强（见图7C和图7D），表明LcMYB44是柠檬醛生物合成的重要调控因子。另外，调控了萜烯类物质生物合成的关键酶基因，如LcDXS4、LcDXR、LcHMGS1、LcGPPS.SSU1和LcTPS42，它们在其启动子中含有MREs，也表达水平上调（见图7E）。
在TRV-LcMYB44株系中，萜烯类物质的产量增加伴随着LcDXS4、LcDXR、LcHMGS1、LcGPPS.SSU1和LcTPS42的表达水平分别增加了3.9倍、1.7倍、1.9倍、3.3倍和1.8倍。
在LcMYB44瞬时表达后，LcMYB44的表达水平增加了大约3.7倍，同时LcADH28和LcADH29的表达显著下降（见图7F和图7G）。
LcMYB44的过表达也导致了geranial和neral的产量显著下降。在LcMYB44渗透后的叶片中，geranial和neral的含量分别为2.15 μg g−1和1.14 μg g−1，与注射空载体的叶片相比（4.49和2.25 μg g−1），呈现出显著的（P < 0.01）下降（见图7H）。
这些结果表明，LcMYB44可能对山胡椒中的柠檬醛合酶基因簇和特定的萜烯类物质生物合成途径基因产生负面影响。
图7. 利用病毒诱导基因沉默（VIGS）抑制LcMYB44增加了山胡椒中柠檬醛和其他萜烯类物质的含量。
A) 通过实时定量PCR（qRT-PCR）测定的LcMYB44的相对表达水平。
B) LcADH28和LcADH29的相对表达水平。
C) 对照植株（TRV）和VIGS植株（TRV-LcMYB44）中柠檬醛的相对含量。
D) 对照植株（TRV）和VIGS植株（TRV-LcMYB44）中其他萜烯类物质的相对含量。
E) 通过qRT-PCR测定的LcDXR、LcDXS4、LcHMGS1、LcGPPS.SSU1和LcTPS42的相对表达水平。
F) LcMYB44在山胡椒叶片中的瞬时过表达。通过qRT-PCR测定的LcMYB44的相对表达水平。
G) 通过qRT-PCR测定的LcADH28和LcADH29的相对表达水平。
H) LcMYB44的过表达显著降低了柠檬醛的浓度。
04
结论
这项研究发现了一种特定于樟科植物的柠檬醛生物合成基因簇，其中MYB44充当调控因子，而ADH28和ADH29则是修饰酶。这个基因簇在樟科植物中呈现出多样性。ADH28和ADH29分别催化了香叶醇和柠檬烯醇转化为香叶醛和柠檬烯醛。值得注意的是，ADH28更倾向于使用香叶醇作为底物，而ADH29更偏向于柠檬烯醇。此外，MYB44通过结合在它们各自启动子中的MRE位点来抑制了ADH28和ADH29的表达。这些特定的代谢途径参与了柠檬醛的生物合成，这可能有助于植物适应特定环境。该研究为理解植物萜烯类物质生物合成的演变和调控机制提供了重要见解。
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原文链接：
https://doi.org/10.1093/plphys/kiad553
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