文献分享|苯并噻二唑衍生物作为荧光成像染料：新一代探针的十年

▉ 导语

摘要

本综述描述了荧光2、1、3-苯并噻二唑(BTD)衍生物，自首次被用于生物成像实验以来，近十年时间的使用进展。该综述描述了含BTD的荧光团的使用，特别是用于成像细胞核、线粒体、脂滴、传感器、蛋白质和相关事件的标记物、生物过程和活性、溶酶体、质膜、多细胞模型和动物。还描述了常见于BTD荧光结构的一些物理化学和光物理特性。

BTD衍生物的特征理化性质

BTDs优先以醌类形式存在（方案1)，尽管芳香族和两性离子芳香族(叶立德）形式也有助于它们的光物理性质。这些内消旋的形式在能量上并不相等，因此干扰了结构的带隙能量。BTDs的电性能和光性能可能受到这些形式的影响。BTD荧光染料的发射波长表明了实际效果，而BTD荧光染料又可以作为生物成像探针应用于整个可见光谱中。电子受体醌类结构通常用于减少带隙能量，如在小带隙聚合物中观察到的那些。醌类形式的主导降低了LUMO（最低未占据的分子轨道）能量，从而使其能量更接近HOMO（最高占据的分子轨道）。根据所使用的取代基，BTD衍生物的带隙能量和发射颜色可以进行调整。BTD核心的强电子接受特性通常用于设计和合成D-π-A结构。D-A结构中的π间隔区对π-偶联有影响，因此也影响荧光BTD的光特性，但原则上，它对稳定来自激发态的分子内电荷转移(ICT)并不是必要的。ICT通常从供体部分到BTD核心（方案1）。BTD的核心是一个极性杂环。激发后，BTD衍生物通常显示出极性ICT倾向的激发态。优先的正醌类BTD核及其永久电偶极矩能够影响BTDs的溶解度、结晶度、载流子迁移率以及后续的光物理性质。BTD核心的疏水特征通常通过在结构的4,7位进行π-扩展(如Ph，C=C或C≡C基团)来改善。BTD核心被描述为疏水结构并不罕见。

方案1 （上）BTD杂环的内消旋形式突出了醌类形式（主要贡献）。（下）显示了一个具有一般供体基团的非特异性荧光BTD衍生物（绿色），其可信的ICT过程（黑色）和BTD核心的强电子受体特性（红色）。

BTD衍生物的一些具有吸引力的特征如下：

1. 一般来说，π-扩展的BTD结构是稳定的，当这些荧光团发光时，没有注意到降解

2. BTD核心的缺电子特性对于规划具有高效稳定过程的新稳定结构具有重要意义

3. BTD衍生物通常表现出良好到优良的热稳定性

4. 荧光BTD衍生物通常显示出较大的Stokes位移，从而避免了不希望的背景干扰，并通过使用适当的滤波片有效地阻止激发光到达探测器

5. 较长的照射时间通常是可能的，而不会褪色

6. 明亮的发射，没有明显的肉眼闪烁

7. 在生物成像实验中，通常可以获得良好到优秀的信噪比

8. 大多数描述的荧光小有机BTD被证明能够转运细胞膜，只有少数例外, 用于选择性染色质膜的BTDs没有穿过质膜，但与该细胞器表现出很强的相互作用，这将在本文中讨论

9. 大多数荧光btd可以在400nm以上（可见光区域）被激发。因此，可以避免细胞自身荧光，激光强度较低，可以避免温度升高，不引起氧化应激，可以防止形态学改变，有利于获得高质量的图像。

10. 衍生物的亲脂性可以通过适当选择取代基来调整，从而帮助将结构引导到特定的细胞区域或特定的生物反应。

11. 理论计算可能非常有用，并有助于预测在其他地方演示的光特性

12. 一般来说，通常在室温下，BTD可以作为纯固体或溶液存储，并准备用于生物成像实验。大多数市售的试剂盒需要存储在-20到-80°C之间，并且容易被自由冻融循环降解。

核选择性染色

在BTD核心的4,7-位上包含的已知染料的结构能够进行ESIPT（激发态分子内质子转移)，因此直接影响最终框架的光物理性质(图2）。两种BTD衍生物对dsDNA的亲和力在使用这些染料选择性染色的生物实验中得到了证实。与已知的能染色细胞核的市售DAPI相比，使用所开发的荧光团可以观察到更好的结果。BI和BT在细胞中具有较低的水溶性和沉淀性，而BTD荧光团(BTD-BT和BTD-BI)具有较高的水溶性，从而允许在细胞核中进行高效的dsDNA染色。

图2。（左）荧光设计的BTDs作为活细胞荧光成像探针，用于染色人类干细胞细胞核中的dsDNA（右）。

  具有最小选择、倾向和非特异性染色的结构

一些BTDs已经在生物成像实验测试为所谓的最小选择性，也就是说，这些荧光染料可以分散在细胞的细胞质，但没有穿过核膜，因此观察到细胞核，但没有任何偏好特定的细胞器的细胞质区域（图3）。其他一些BTDs已被证明能够以非特异性方式对整个细胞的细胞膜和核膜进行染色（图3）。然而，在这两种情况下，生物成像的应用都是相当有限的。

图3 荧光BTD衍生物与最小的选择和非特异性染色

  线粒体选择性染色

作为真核细胞的DNA携带细胞器，线粒体大小为0.5~1.0μm（直径）。线粒体(≈-180mV)的负膜电位在其脂质双分子层中不断保持。离子通道泵和氧化通道辅助细胞器来维持这种非常负的电位。图4显示了已经描述的用于选择性染色线粒体的荧光BTD衍生物的结构。

图4 荧光BTD衍生物用于线粒体选择性染色

  脂滴(LDs)选择性染色

LDs主要由胆固醇、甾醇酯和甘油三酯中性脂质核组成。这个核心被一个包含多个关联蛋白的磷脂单层壳所覆盖。当中性脂质在细胞中达到临界水平后，它们组装成脂滴结构，主要负责能量储存。BTD核心的荧光探针（图5）已有一些用于靶向脂滴。

图5 用于选择性染色LDs的荧光BTD衍生物

  细胞内不同分析物的传感器

荧光BTD衍生物也被用作几种分析物的传感器（图6），尽管与经典的支架基荧光团相比，它开始的时间较晚。

图6 荧光BTD衍生物被用作细胞内几种分析物的传感器

  使用基于BTD的生物探针的蛋白质检测和可视化

使用基于BTD的生物探针（图7）来可视化和监测蛋白质是最近出现的。

图7 用于蛋白质可视化的荧光BTD衍生物及其相关过程

  监测生物过程和活动

荧光BTD衍生物也被应用作荧光生物探针来监测不同分子的不同过程和活性（图8）。

图8 用于监测生物过程和活动的荧光技术

  溶酶体选择性染色

蛋白质、核酸、碳水化合物和脂质是溶酶体中通常降解的生物分子。考虑到内吞途径，溶酶体是末端隔室。在溶酶体中发现了许多不同类型的水解酶，如脂肪酶、核酸酶、糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、磷酸酶和硫酸盐酶。所有这些酶在酸性条件下通常具有最大的催化活性，因此溶酶体的平均pH值在4.5到5.5之间。虽然大量的荧光染料用于可视化溶酶体及其细胞事件，但到目前为止，只有四种荧光BTD衍生物（图9）被描述为选择性生物成像探针来染色这个特定的细胞器，它们都是最近发表的。

图8 荧光BTD衍生物具有选择性的溶酶体染色

  质膜选择性染色

虽然PM的重要性，但直到最近，基于BTD的生物探针才被专门报道为选择性荧光细胞成像探针（图9）。

图9 荧光BTD衍生物可选择性地进行质膜染色

  与BTD结构相似的选择性荧光染料

一些类似于BTD成功应用于荧光生物成像探针的结构如图10所示。

图10 荧光结构与BTD杂环相似

▉ 小结

本文回顾了荧光BTD作为生物成像探针的应用的巨大发展。自2010年首次发表以来，一些细胞器、细胞过程、多细胞模型和动物目前被荧光BTD衍生物染色。

参考文献：

Neto, B. A. D.;  Correa, J. R.; Spencer, J., Fluorescent Benzothiadiazole Derivatives as Fluorescence Imaging Dyes: A Decade of a New Generation Probes. Chemistry 2021.

DOI: 10.1002/chem.202103262