CNGBdb组学/数据库系列课程开讲啦!
2019年10月17日<第八讲>上线
课程名称：PCR 入门之基础篇—追根溯源
讲师：徐怀前/华大股份科技服务业务定制化项目负责人
负责科技服务业务的微量DNA/外显子、TBS、RRBS、Medip、ATAC-seq、Hi-C、HMST、10xgenomics、cirRNA、RIP-seq、微量转录组、免疫组库、流式细胞分选等业务，具备丰富的高通量建库相关经验。
5200+人都在围观本期课程
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课程概要
PCR技术起源：
> 分离出耐高温Taq DNA聚合酶（1973年钱嘉韵）
>发明PCR(1983年Mullis)
>Taq DNA聚合酶应用于PCR（Saiki ）
PCR各成份主要作用及影响（关注要点）：
>引物设计（长度、GC含量、引物二聚体、5'和3'端碱基、引物溶解和保存）
>dNTPs（浓度、储存液PH、储存温度）
>二价阳离子（Mg2+＞Mn2+，Ca2+无效、浓度）
>PCR缓冲液（PH、浓度）
>反应促进剂
>DNA模板（GC含量、结构、模板量）
>DNA聚合酶（热稳定DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶）
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现场Q&A
Q：如何避免PCR循环产生的错误率？
A：1. 在PCR产量满足下游实验的情况下，PCR循环数越低越好；2. 使用高保真PCR聚合酶。
Q：肝素是如何影响PCR反应的？
A：血液提取后，肝素容易和DNA紧密结合在一起，很难被清除掉，会导致pcr反应效率低或失败。
Q：甲基化转化后产物扩增引物设计需要注意什么？
A：尽量避免在甲基化的C区域设计引物，尤其是在3’端的时候，尽量选择A、T、G含量比较多的区域设计引物。
Q：建库过程中哪一步异常会造成最后文库的GC含量比正常高2%个点，是否有可能是PCR的步骤中引入？
A：只要是生物学实验都存在bias，只是bias的大小不同，不论是末端修复还是加接头，都有偏好性，但是我认为这些都不是关键，我个人认为影响GC含量的关键是PCR酶的选择。
Q：引物设计的关键有哪些？
A：可参考我们PPT上引物设计的几个关键点，具体引物设计需要根据具体情况做调整。
Q：退火温度比Tm值低，为什么？
A：退火温度比Tm值低5~10度左右，这是一个经验参数，此时引物退火效率比较高，并且不会导致太多非特异性结合。
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