不从组织内的各个部分(或细胞)中提取RNA分子,而是直接在其原始环境中对其进行可视化,这可以通过与感兴趣的目标互补的标记探针杂交来实现。
原位杂交(ISH)利用标记的核酸探针来确定组织和细胞中DNA和RNA的空间位置和丰度。之后不断进化,形成了单分子RNA荧光原位杂交技术(smFISH)。smFISH利用多条短的寡核苷酸探针(大约20 bp)来靶向同一mRNA转录本的不同区域。2008年开发了一种替代性的smFISH方法,使用一组≈40个探针(20bp),每个探针耦合到一个单一的荧光团。虽然smFISH具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率,但由于标准显微镜中光谱重叠的固有限制,它一次只能针对几个基因。
seqFISH是一种多路smFISH方法,通过连续几轮杂交、成像和探针剥离,多次检测单个转录本。然而,杂交轮数的增加需要增加smFISH探针的数量,这使得seqFISH既昂贵又耗时。
为了弥补seqFISH的大量耗时,2015年发布了MERFISH技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量,并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。2018年,MERFISH技术与扩张显微镜相结合,通过扩大RNA目标之间的距离,可以在没有光谱重叠的情况下使检测到的分子数量增加。
2019年,seqFISH的研究小组也采用了与MERFISH有些相似的方法,即使用包含侧翼区域的主探针一步定位,随后多次读取探针循环。该方法允许使用标准共聚焦显微镜的10000个基因的目标复用,而不需要超分辨率设备。然而,这种策略仍然是基于先验地决定目标,并且需要使用大量的合成探针集。
osmFISH是一种非条形码技术,osmFISH的靶点数量设置为杂交轮数,其中每一轮杂交包括一定数量的基因的探针集。每一轮杂交后,获得图像,然后去除探针,进行下一轮杂交。虽然osmFISH与其他smFISH技术相比具有较低的复用能力,但它在处理较大组织区域的能力方面表现突出。
2011年,Advanced Cell Diagnostics推出了商业化的RNAscope芯片。该检测的核心是探针设计,两个相邻的 "Z-probes "与目标RNA转录物结合,形成所需的结合位点,供后续的放大分子杂交使用。2019年7月,同时检测RNA靶点的最大数量增加到12个。低倍数RNAscope还与成像质粒细胞仪(IMC)相结合,用金属标签代替荧光团对DNA树进行杂交。随后,将金属结合的抗体添加到同一组织切片,并进行金属丰度的质细胞测量,允许同时进行RNA和蛋白质评估。
2019年,提出了一种被称为 "DNA显微镜 "的核苷酸无光学图谱,它不依赖于从已知位置的物理捕获,而是依赖于热力学熵。与传统的成像方法相比,DNA显微镜的原理意味着一个相当奇怪的反向特征,信号的稀疏性成为挑战,而高信号密度意味着更容易重建。迄今为止,该技术只对培养细胞上的一小部分转录本进行了演示。