亚硫酸氢盐转化法被认为是DNA甲基化分析的金标准。由于它的高转化率(>99%)、可重复性和通过商业试剂盒的简单易用性而受到研究人员的青睐。然而,亚硫酸氢盐转化法采用了导致DNA降解的苛刻反应条件,PBAT的开发即是为了解决降解造成的损失问题。
在单细胞 DNA 甲基化分析方法中最大限度地减少 DNA 损失的关键策略
RRBS和WGBS是流行的全基因组甲基化分析方法。 这两种方法都包括亚硫酸氢盐转化和NGS制备。主要区别在于,RRBS使用适当的限制性内切酶和大小选择来筛选富含GC的区域。WGBS(特别是MethylC-seq)的优势在于能够覆盖基因组中的大部分CpGs。与RRBS相比,WGBS的纯化和筛选过程相对简单。在WGBS中防止亚硫酸氢盐转化过程中的降解损失被认为是相对重要的,因此许多基于WGBS的单细胞方法往往是基于PBAT的。
多组学方法是根据甲基化分析方法与其他分析方法(RNA、染色质可及性)相结合来区分的。例如scM&T-seq是基因组和转录组测序(G&T-seq)与scBS-seq的结合,G&T-seq是一种基于Smart-seq2识别DNA和RNA的方法。此外,应用于单细胞甲基化分析方法的技术,如PBAT,也可以类似地应用于NOME-seq,NOMe-seq可以根据核糖体的存在与否,利用GpC甲基转移酶的染色质可及性差异,确认双硫酸盐转化的DNA中开放染色质和CpG甲基化。scCOOL-seq、iscCOOL-seq和scNome-seq可以一起监测染色质可及性和CpG甲基化。
通过转化以外的方法观察甲基化主要分为两类:利用甲基胞嘧啶的亲和结合和利用限制性内切酶对甲基胞嘧啶的敏感性。MBD-seq和MeDIP-seq是具有代表性的基于亲和性的方法。基于亲和力的方法不适合在单细胞规模上应用,因为这些方法基于DNA片段产生平均DNA甲基化谱,这不允许区分单个细胞中DNA甲基化模式的差异。然而,与基于亲和力的方法不同,基于MSRE的方法可以被改进,使用MSRE的单细胞方法的细化可以在Methyl-seq中看到,scCGI-seq测量甲基化的方式与Methyl-seq类似。