实用干货 | FFPE样本DNA测序的策略和建议

好好利用 FFPE样品

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE) 的组织样本是世界各地病理实验室保存临床组织样本的标准方法。随着核酸测序技术的发展引起了人们对使用生物库中存储的历史FFPE样本的兴趣。然而，福尔马林固定会化学修饰DNA，这可能导致下游处理和数据分析中的错误。2023年6月，《Nucleic Acids Research》发表综述文章，回顾了 (I) 分析前样品质量控制、(II) DNA 修复处理、(III) 分析样品制备和 (IV) FFPE-DNA 生物信息学分析中的缓解策略，并提出建议。

福尔马林诱导的DNA改变：FFPE-DNA中的修饰大多是伪随机发生的，但在富含AT的基因组区域更常见，导致富含 GC的序列比FF-DNA中的发生率更高。碱基修饰、链间交联、碱基切除、多聚脱氧核糖断裂和胞嘧啶脱氨基等构成了FFPE-DNA Artefacts。

福尔马林固定的后果：福尔马林的修饰很复杂，至今仍未完全理解。Artefacts可能被误认为是真正的变异，尤其是当它们的等位基因频率超过过滤阈值时，这会出现在局部低覆盖率的区域，而这又是由文库复杂性降低和覆盖率不均匀造成的。

分析前样品质量控制

分析前样品的质量控制对于从旧样品或小样品（例如针吸活检）中提取的FFPE-DNA尤为重要。预分析程序中最重要的是样本采集和固定程序。组织脱水、固定延迟、固定时间过短或固定时间过长都会损害标本质量。

提取的FFPE-DNA的质量主要取决于福尔马林浓度和pH值、固定温度、样品厚度和固定时间以及标本保存条件。未记录收集和固定方案的标本应准备好所有适用的预防措施，并进行相应的解释。在制备这些标本的核酸提取液时，应丢弃FFPE块表面暴露在空气中的切片，因为块表面的组织区域容易氧化。理想情况下，目标细胞(如肿瘤细胞)应该在切片(或打孔材料)中富集。脱石蜡通常使用搅拌进行，但应首选更温和的无搅拌方法。在提取方案中应包括在水溶液中隔夜的蛋白酶K消化。值得注意的是，FFPE-DNA提取试剂盒的性能各不相同。如果需要浓缩所得的FFPE-DNA洗脱液，则不应施加额外的热量，因为这会导致进一步的DNA降解。相反，冻干(冷冻干燥)是一种更好的浓缩方法。一般来说，FFPE-DNA 的制备应小心（例如温和混合、避免不必要的冻融循环），以最佳地保持其完整性。

小结：只要满足特定条件，即使是10年前的FFPE标本，也可以获得有意义的序列输出。重要的是，建议使用中性缓冲福尔马林进行固定，并使用尽可能高的FFPE-DNA输入量。考虑到影响样本质量的许多变量，在大规模研究之前，用一个小型的原理验证试点研究来探索特定样本收集的适用性是有意义的。试点研究也可以考虑纳入FFPE参考材料，只要参考材料与研究样本具有相似的质量。

靶组织(如肿瘤区域)应进行最佳富集。FFPE-DNA提取至关重要，应谨慎进行。平均片段长度是一个易于确定的度量，与覆盖均匀性相关，这是FFPE-DNA测序中最重要的质量标准之一。

DNA 修复处理

提高下游分析性能的DNA处理可以基于三种不同的原理：（i）热处理，（ii）单步酶处理或（iii）多步酶处理。

酶促FFPE-DNA修复处理原理

为了说明基于 BER 的 DNA 修复处理如何消除Artefacts，研究团队使用市售的 FFPE-DNA修复混合物作为基准，与使用不同糖基酶的基于BER的顺序修复方法、体外顺序碱基切除修复（“IQBErepair”）进行了比较。

FFPE-DNA修复对靶序列覆盖和Artefacts的影响

小结：对于体积小且不可替代的标本，修复处理受损的FFPE-DNA是一种选择。这种处理尤其可以考虑用于珍贵的历史样本，或用于罕见临床条件的集中、假设驱动的研究。在这种情况下，建议使用基于BER的修复方案来恢复基于互补链的片段，而不是单独的糖基化酶处理。如实验示例所示，FFPE-DNA中完整片段的固有低可用性导致局部低覆盖区域的覆盖均匀性差，其中伪影导致更强烈的信号。这是在严重受损的FFPE样本中正确分析和解释突变谱需要克服的关键障碍。

分析样品制备

从FFPE-DNA进行文库制备和可选的目标片段富集的步骤在此统称为分析样品制备步骤。由于样品可变性（损伤、碎片等），很难以高通量规模制备用于NGS的FFPE-DNA。通常通过剪切进行片段化，以生成NGS所需的DNA大小。FFPE-DNA需要比标准方案更温和的剪切设置才能实现这些所需的片段大小。理想情况下，片段参数应针对单个样本进行微调，以避免过度片段化，或者，当DNA已经极度片段化时，可以跳过片段化步骤。即使 FFPE-DNA相对完整，由于单链断裂和AP位点的存在，它也相当脆弱，因此应极其温和地处理。

FFPE-DNA是否应采用超声或酶促方法的问题是有争议的。超声波破碎似乎会导致不可逆的DNA损伤，根据研究团队的经验，使用测试的FFPE-DNA修复处理无法补救。然而，超声处理也有一定的优势，例如它可以更好地控制片段大小，并且它可以很好地从池中去除受损的DNA分子。当应用超声处理时，应避免引入额外的氧化碱改变，为此，超声处理最好在Tris-EDTA缓冲液中进行。

核苷酸突出端和 dA 尾的末端修复（通常在超声处理方案中进行）构成了另一个关键步骤，可以使Artefacts被固化。Tagmentation或其他其他酶裂解技术是超声波裂解的温和替代方法。据报道，Tegmentase文库具有良好的输入效率，并且在高质量FFPE-DNA方面的结果与FF-DNA相当。最后，对于高质量的FF-DNA，测得的输入质量几乎等于可用的DNA数量。相比之下，测得的FFPE-DNA的输入质量通常高估了可用的DNA部分，因此应相应地调整数量。

靶向富集已成为增加感兴趣基因组区域覆盖率和减少FFPE引起的噪声的标准做法。当材料足够时，可以准备来自同一样本的技术重复样本，因为这些样本可以极大地减少假阳性。使用可以被UDG和核酸内切酶VIII切割的发夹接头切割的发夹适配子的文库制备方法可能有助于提高文库转化率，从而提高文库复杂度。利用FFPE-DNA中存在的单链DNA（ssDNA）来制备文库的方法还可以进一步提高文库的复杂度，从而改善输出结果。由于ssDNA存在较高水平的Artefacts，建议通过应用专用的底物酶处理来抑制其贡献，因为由于缺乏互补模板链，无法恢复原始基因组序列。

与未经处理的DNA相比，使用单一文库方法，DNA修复可以将Artefacts数量减少20-40%。可以考虑使用多文库方法来改善这些结果。与可用于在文库水平上去除Artefacts的复制策略相反，独特分子标识符（UMI）能够在分子水平上进行生物信息学过滤。

置换分析以确定TOP文库复制策略

双端UMIs在FFPE-DNA测序中的分析使用

小结：对于测序研究，与FF-DNA相比，研究团队推荐采用各种工作流程的改进措施，如更温和的样品单独制备和剪切条件，使用更高的输入量的FFPE-DNA，应用单步反应的靶向富集技术，并进行重复实验。重复文库可以提高生物信息学变异分析的特异性，尤其是在预期样本中存在低等位基因频率突变时。当肿瘤突变等位基因频率通常较低时，存在肿瘤内异质性，对于从中分离出FFPE-DNA的FFPE组织样品中的低肿瘤含量，或者对于具有转移潜力和临床可操作性的亚克隆突变的检测，推荐使用重复文库方法进行肿瘤突变负荷分析。具有双重UMI的文库制备试剂盒特别适用于低多样性的严重受损的FFPE-DNA，但需要进行更深入的测序才能充分利用它们在生物信息学过滤中的潜力。一般来说，FFPE-DNA比未损坏的 FF-DNA 需要更深四倍的测序。如果目标是双端UMI链特异性纠错，则需要非常深的测序(例如5000 - 7500x)。

生物信息学分析

生物信息学分析旨在从大量生成的序列数据中识别最相关的信息。从FFPE-DNA导出的数据与FF-DNA数据明显不同，并且通常受到低覆盖区域、短插入片段和Artefact库变化的影响。因此，有必要优化FFPE样本的生物信息学分析，以尽可能最好地纠正这一点，同时必须保持敏感性和特异性。

生物信息学过滤是计算包含或排除标准的应用，可以使用单一标准（如变异质量得分过滤）或任意复杂度的多个标准（如变异质量和感兴趣基因）。在FFPE-DNA序列分析中，常见的做法是排除检测到的等位基因频率低于5%或10%的变异，这可能排除了重要或感兴趣的真实变异。因此，相关研究建议可以手动重新分析VAF<10%的此类排除的感兴趣变异。等位基因频率阈值取决于研究问题：对于种系突变，可以使用20%的阈值。在肿瘤材料中进行体细胞变异检测时，希望的阈值可能低至1%，具体取决于预期的肿瘤含量。

目前生物信息学过滤的方式有多种，例如可以对比对序列的映射质量进行生物信息学过滤；概率变异检测器使用统计模型评估观察到的变异的多个特征，并计算它们作为Artefacts的概率；机器学习技术已被用于更广泛的特征集来对变异进行分类。通常，研究团队建议根据样品质量调整生物信息学设置。在去除大多数FFPE Artefacts的同时，如果滤波器设置了过于严格的阈值，则低覆盖区域的弱真信号可能会丢失。因此，研究团队建议在样品纯度较高时(肿瘤细胞含量≥50%)谨慎使用确定性和概率过滤器，而在样品纯度或DNA产率较低时则采用更保守、谨慎的方法。

概率生物信息过滤器持续减少Artefacts

下图总结了应用于相同下采样数据集的不同生物信息学方法的效果，显示了如何根据过滤方法减少reads数。基于双端UMI的纠错可能并不总是分析严重损坏的 FFPE-DNA 的最佳方法。如果目标区域大小很大（如在全外显子组测序中），则利用UMI重复数据删除结合最佳应用的VAF阈值进行变异调用的过滤方法可能比需要非常深度测序的一致纠错更经济。

四种生物信息学read过滤方法对具有双重UMI的文库序列的影响

小结：生物信息学过滤器可以帮助区分真正的变异和伪变异。不同的UMI过滤器和错误校正策略可以显著减少伪变异，但会降低覆盖度。这可能会减弱对低变异频率真实变异的敏感性。

对于储存几年的标本，FFPE-DNA测序可以可靠且相对容易地进行，用于种系和其他研究，其中等位基因频率低于50%的变异并不重要。在这里，DNA片段化标准可以用于选择合适的样本并排除不合适的样本进行测序。对于混合细胞群或体细胞突变，其中低频等位基因可能很重要，研究设计者必须考虑DNA修复、最合适的文库制备和合适的生物信息学分析。

建议使用所有可用的FFPE-DNA进行测序文库制备，而不是像对新鲜、未固定的 DNA 进行测序时常见的标准化等分量。FFPE-DNA很脆弱，必须小心处理。需要专门针对FFPE-DNA优化文库方案，以确保DNA到文库的转化成功。如果需要超声破碎，应在缓冲溶液中进行，以最大限度地减少DNA氧化。好的替代品是基于标记酶和酶的方案。这些提供了超声处理的温和替代方案，并且适用于比基于PCR扩增子方案更大的目标区域尺寸。

分析FFPE-DNA序列数据的主要挑战是，尽管总测序reads输出令人满意，但覆盖范围不均匀。文库制备过程中的drop-outs导致这些关键的低覆盖区域。因此，如果感兴趣区域中的独特reads没有足够的测序深度，则无法将Artefacts与真正的变异区分开来。更深入的测序来补偿丢失可能会恢复更多独特的reads。

独特reads的数量也可以通过使用基于BER的方案对受损DNA进行酶修复来增加，从而增加可用DNA的量。然而，根据研究团队的经验，基于BER的修复方案（NEBRRepair，IQBErepair）会导致修复后测量的DNA量减少10-40%，特别是在低浓度样本中。因此，只有当测序的独特碱基的增加量超过酶修复DNA的损失时，基于BER的方案才是有益的。在研究团队的测试实验中，NEBrepair并没有提高覆盖均匀性，但IQBErepair能够将独特碱基增加53-80%。

展望未来几年，研究团队预测可以使用现有的方法对数千万个 FFPE 样本进行科学评估。罕见的肿瘤实体和软组织肿瘤可能是FFPE-DNA测序的特定靶点。研究这个集合将使癌症实体能够被分析并分层为具有不同突变特征的特定癌症子实体，为更好地了解预后和治疗失败或提高生存率和治疗提供基础。

需要进一步的研究来解决DNA数量有限(例如针头活检)和许多FFPE样本质量差的挑战——包括改进DNA提取、DNA修复和DNA到文库的转化率。FFPE ssDNA的新库转换方案最近提高了显著增加可用DNA数量的希望。通过进一步改进修复技术来恢复更广泛的福尔马林诱导的DNA改变也可能有助于改善覆盖范围的均匀性。最后，与FFPE-DNA分析相关的特定生物信息学需求将需要分子生物学家、数学家、统计学家和生物信息学家的新专业知识。目前，FFPE序列数据集的评估可能是既困难又耗时的，这突出了对新的创新统计算法的需求，这些算法可以从FFPE测序重复中提取最佳数据。新的算法需要包含易于解释的图形，可靠而全面地总结结果，以最大限度地提高这些工具的有效性和部署。

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参考文献

Steiert T A, Parra G, Gut M, et al. A critical spotlight on the paradigms of FFPE-DNA sequencing[J]. Nucleic Acids Research, 2023: gkad519.