什么是Ct值和S/P值？常规检测中蓝耳抗体S/P值高低各代表什么？

导 语：今天的问诊案例，涉及到两个常见词汇：S/P值和Ct值。你可能常听到S/P值越高，抗体浓度越高。Ct值越低，感染某某猪病的可能性越高。但你是否懂其中的原理？先解决概念问题。
什么是Ct值？
想要知道Ct值，先要了解PCR。PCR，聚合酶链式反应，DNA聚合酶介导的合成DNA链的反应。是对目标DNA片段进行扩增（大量的翻倍复制）的方法。
为什么对DNA进行扩增？因为通常情况下病毒DNA的含量太低了，即使是经过了提纯，仍然没办法直接测量有无和多少，所以需要通过PCR技术扩增。以目标DNA为模板，对这段DNA进行复制粘贴，使这段DNA能够检测到的量，甚至达到可以用肉眼看的到的量。
扩增一次需要一个特定流程，即通过高温使一个双链DNA拆成两个单链，然后降温到聚合酶的活性温度，聚合酶以两个单链DNA作为模板，生成两个新的双链DNA，即实现了对原来DNA片段的“克隆”。所以PCR仪本质是一个温控设备，而其中用到的聚合酶当然也必须是可以耐高温的聚合酶。
如何确定要复制哪一段DNA，这时候就需要使用引物（与目标DNA序列互补的一个短片段）来开个头，引导后续的合成，这样就确保只对目标DNA序列进行扩增。
通过一次这样的程序，1个目标DNA片段变成了2个。而之后的流程则是重复这个程序，所以一个这样的程序称为一个循环（Circle）。原理上，如果只有1个目标DNA片段，经过1次循环获得2个同样的DNA片段，如果经过5次循环得到2^5个同样的DNA片段即32个，如果40个循环得到2^40次方个这个DNA片段，即1,099,511,627,776个。当然如果原始样本里没有目标DNA，0^40次方仍然是0。
当然，这里有个前提，就是必须有足够量的合成原料，即引物和游离核苷酸。所以PCR反应中产生的DNA片段与细菌增值曲线类似，前期指数增长，后期原料耗尽则曲线拉平。
Ct值
在PCR技术的基础之上，通过一定的技术设计，可以实现对合成的DNA的数量进行实时定量检测，也就是实时定量PCR技术，qPCR。

而测量的方法则一般是通过检测荧光信号的强度来实现，比如可以在反应体系中加入荧光染料（方法之一），这种染料特异性的掺入DNA链之后就会发出荧光。制造出的目标DNA片段数量越多，则发出的荧光越强。

给荧光强度设定一个检测阈值，即所需测量的荧光的强度超出背景荧光强度的临界点（也就是Ct中的t，threshold），当需要测量的荧光强度超过这个阈值时，这个时候跑了多少个循环（Ct中的C，circle），如果跑了25个循环，那么Ct值就是25。
当原始样本中目标DNA的越多，达到这个临界值所需要的循环次数越小，所以Ct值越小意味着，原始样本中这种DNA的浓度就越高，对于非瘟检测来说，就是感染越严重。
通常实时定量PCR跑40个扩增循环，如果Ct值小于29被认为是强阳性，如果Ct值在30-37之间认为是阳性，Ct值在38-40则可能是含有最小量的目标DNA，也可能是环境污染。

什么是S/P值？

简单的说，S/P值是酶联免疫吸附检测（ELISA）的一种结果形式。
酶联免疫吸附（ELISA）

检测抗体的方法很多，酶联免疫吸附是最常用的。酶联免疫吸附法检测抗体的大体原理是：
先在反应容器的表面（微孔板）附着上需要检测的抗体的特异性抗原，用来捕获受测样本中的抗体。把受测样本注入微孔后，样本中的抗体就会被之前加入的抗原捕获在容器表面。
冲洗掉其他东西，剩下的就是没用完的抗原和捕获了抗体的抗原。这个时候当然不能直接去数有多少个抗体，因为抗体太小了，是一个很弱的检测信号，需要把这个信号放大。而酶就是那个信号放大器。
把酶连接在所测抗体的抗体上（抗抗体）构成酶标抗体，把酶标抗体加入刚才的反应容器，同样的原理，酶标抗体会被抗体捕获。没被捕获的酶标抗体会被冲洗掉。这个时候再加入显色液，显色液在酶的作用下变色，被捕获的酶标抗体越多，颜色越深。通过这种方法间接的实现了对抗体的有无和多少进行了显示。
此时可以用肉眼直接观察，但是如果要精确测量就需要用到一个比色计（酶标仪）。比色计的原理是向样品孔中照射特定波长的光，测量有多少光被吸收，就能得到每个样品孔的吸光度的值。
吸光度值与抗体浓度存在一一对应的关系，因此只需要找到这个关系就可以把吸光度值转化成抗体的浓度值。

一种方法是，把阳性标准品做梯度稀释，然后把不同稀释浓度的吸光度值做一个标准曲线，然后拿样品的吸光度值去曲线上比对，就能够获得样品中抗体的浓度数值。

当然还有更简便的方法，即不做梯度稀释，直接用样品的吸光度值跟特定浓度的标准品吸光度值进行比对。这也就是S/P值方法。
S/P值是一个比值。即S——Sample样本的吸光度值，比，P——Positive阳性对照的吸光度值。完整公式是：
S/P = (样本值-阴性对照值)/（阳性对照值-阴性对照值)
所以如果S/P≥1 时，当然肯定是阳性，说明样本中抗体的浓度等于或超过了阳性对照的浓度。S/P的值越大，抗体浓度越高。
如果S/P<1，会稍微复杂一些，小于1说明样品中的抗体量小于阳性对照的量，但是少多少才是阴性？所以这个时候就需要用一个分界值来判定。这个分界值，一般需要厂家测量之后根据敏感度和特异度进行制定，比如有的厂家蓝耳病抗体的临界值设置为0.4，也就是当S/P<0.4 则可以判定为阴性，如果S/P>0.4则判定为阳性。

再回到我们今天的问诊案例。

问诊案例一：

养猪人：蓝耳灭活苗与蓝耳活疫苗的免疫S/P值看法一样吗？蓝耳检测S/P值是否越大越好？假如免疫蓝耳灭活苗，S/P的数值在多少范围内合理？
曹海涛：你好，目前实验室检测绝大多数都是ELISA试剂盒，它目的蛋白是病毒蛋白的N蛋白，不是中和抗体，所以代表不了中和抗体水平，更不能完全表示中和病毒能力。
我们主要是看猪群的抗体趋势，综合阳性率、离散度、整齐度，再结合临床症状，生产成绩，一起判断疾病的感染规律。无论灭活苗和活苗，都能干扰抗体的变化，请结合上述情况，综合判断，才能更趋近于真实。
养猪人：那蓝耳监测S/P的数值代表什么？离散度高能说明什么问题？S/P值阴性代表什么？S/P阳性代表什么？S/P在1以下，在1到2之间，在2以上，各能说明什么问题？
S/P值超过3能说明什么问题？猪群是不是就不好养了？
曹海涛：S/P值是检测的计算结果，一般需要阳性对照和阴性对照，S/P值=（样品值-阴性对照平均值）/（阳性对照平均值-阴性对照平均值）。一般S/P值大于0.4为阳性，表示曾经感染过野毒或接种过疫苗有抗体；小于0.4为阴性，没有抗体保护，阴性暴露，易感染。
这个抗体是用检测N蛋白的数量而表示的，但不代表中和抗体水平。所以我们需要看整体样本是什么猪，哪个阶段的，再看S/P值的分布，再分析。一般我们经验认为数值大于3.5以上，急性感染；2.5～3.5之间，说明病毒血症几率高；1.0～2.0，稳定群；0.7～1.8，理想群。所以，不能单独看一个或一组数据分析，最好有采样合理分布，和近期3月内其他检测数据，相互结合分析。其实数值大小，和实验室、试剂盒、猪群本身、疫苗、野毒等都有直接相关性。离散度=本组数值的标准差/本组平均值*100%，离散度高，说明整齐度差，感染风险高。
我们采样的置信度很关键，采样分布直接决定结果是否能真实反应检测结果。而且不能单独看一个值或一组值，一定要看趋势。比如母猪个别2.5，符合正态分布，也可能是稳定群；再比如保育猪1.8，也可能病毒血症，易继发细菌感染。如果群体大于3，可能感染野毒，处在病毒血症阶段。

问诊案例二：

养猪人：老师好，产房仔猪睾丸液监测蓝耳抗原阳性，Ct值34。场内猪群未有临床症状母猪群也没有病毒血症，但最近一个月流产指标上升百分之一。这种情况可以正常的进行蓝耳疫苗的普免吗？
苑麟勇：您好，产房仔猪睾丸组织液蓝耳病抗原阳性，说明母猪在排毒或母猪群蓝耳病野毒活跃，这时建议母猪加强一次蓝耳病疫苗，普免前后加强保健！
养猪人：我们正常是1月份进行普免，一年4次。监测到抗原，我是想问一下是先保健一下再进行免疫，还是免疫与保健同时进行？
苑麟勇：建议免疫前后、免疫时可以同时保健！