Roberto Gherzi, Kyung-Yeol Lee, Paola Briata, Daniel Wegmüller, Christoph Moroni, Michael Karin, Ching-Yi Chen
Molecular cell 2004 Jun 04;14(5):571-83 doi:10.1016/j.molcel.2004.05.002
PMID:15175153
固有的不稳定mRNA在其3' UTR中包含富AU元件（AREs），通过与ARE结合蛋白（ARE-BPs）相互作用作为mRNA稳定性决定因素。ARE和ARE-BP相互作用促进mRNA衰减的机制尚不完全清楚。在这里，我们证明了KSRP，一个包含KH结构域的ARE-BP，是ARE导向的mRNA衰减的必要因素。KSRP的一些KH基序（KHs）直接介导RNA结合、mRNA衰减以及与#外泌体 和聚(A)核糖核酸酶（PARN）的相互作用。KHs促进mRNA衰变的能力与它们与ARE结合并与RNA降解酶相关联的能力相关。因此，KHs通过招募含有ARE的mRNA的降解机制来促进mRNA的快速衰变。
哺乳动物mRNA衰减的第一步似乎也是多聚(A)缩短（Shyu et al.，1991）。然而，哺乳动物mRNA衰减的机制步骤并不像酵母中那样明确。体外RNA衰减系统的使用提供了证据，表明3’到5’降解是由哺乳动物#外泌体 介导的，这代表了含有ARE的mRNA的主要衰减途径（Chen等人，2001；王和基尔德建，2001；慕克吉等人，2002)。哺乳动物外泌体很可能通过AREs被招募到固有的不稳定mRNA中。Mukherjee等人认为，人类外泌体的一个核心亚基与AREs特异性结合，这种结合负责ARE定向衰变（慕克吉等人，2002年）。然而，我们发现一些ARE-BP，包括KSRP，在物理上与外泌体相关，并且分离的外泌体优先降解含有ARE的RNA（Chen等，2001）。因此，我们认为外泌体通过与不稳定的ARE-BP的相互作用被招募到固有不稳定的mRNA底物上，这种招募提供了包含ARE的mRNA快速和优先衰变的基本机制（Chen等人，2001；Shim和Karin，2002）。
不同mRNA种类的mRNA稳定性差异很大，在决定基因表达水平方面起着重要作用（古哈尼约吉和布鲁尔，2001；Wilusz等人，2001)。不同的mRNA衰减率是由mRNA分子中特定的顺式作用元件决定的。哺乳动物细胞中最常见的导致mRNA快速衰变的顺式元件是富AU元件（ARE），存在于短寿命细胞因子和原癌基因mRNA的3' UTR内（Chen和Shy，1995；Bakheet等人，2001）。最近对3' UTR的计算分析显示，多达8%的人类mRNA含有AREs（Bakheet等人，2001年）。这一发现表明AREs可能是大多数不稳定mRNA降解的原因。
AREs根据其序列特征和衰减特征分为三类（Chen等人，1995；Peng等人，1996）。I类AREs包含1到3个分散的五核苷酸AUUUA拷贝，嵌在富U区，在c-fos和c-myc mRNA中发现。Il类AREs包含AUUUA基序的多个重叠拷贝，仅在细胞因子mRNA中发现。III类AREs，如c-jun mRNA中的AREs，缺乏标志性的AUUUA，但包含一个富U序列。AREs介导的mRNA衰减的特征是mRNA体的快速多聚(A)缩短和快速衰变（Chen等人，1995；Peng等人，1996；Xu等人，1997）。除AREs外，还描述了几种不含ARE的不稳定元件。茎环不稳定元件（SLDE）包含在粒细胞集落刺激因子mRNA的3' UTR中发现的两个预测的茎环结构（Brown et al.，1996）。另一种通过ARE独立途径促进TNFα mRNA衰减的顺式元件最近被描述（斯托克林等，2003)。
许多蛋白质被描述为与AREs结合（彭等人，1998年；贝维拉奎等人，2003年）。然而，这些RNA蛋白相互作用的功能和生理意义以及它们在ARE导向的mRNA衰减中的确切作用仍然是一个谜。AUF1促进mRNA的衰变，并参与热休克诱导的含ARE mRNA的稳定（Wilson和Brewer，1999；Sarkar等人，2003）。TTP与TNFα和其他细胞因子mRNA的AREs结合，促进它们的去烯化和衰变。缺乏TTP的小鼠表现出TNFα和GM-CSF mRNA周转减少（黑剪切，2002)。BRF1是TTP的近亲，也促进ARE导向的mRNA衰减（斯托克林等，2002)。相比之下，HuR稳定含有ARE的mRNA（彭等人，1998；布伦南和斯泰茨，2001)。
尽管进行了深入的研究，ARE-bp调节mRNA衰减的机制仍然不清楚。此外，由于ARE序列的多样性（Bakheet et al.，2001），很可能存在额外的ARE-bp。事实上，我们之前纯化了一种新的ARE-BP，KSRP（K同源剪接调节蛋白），并认为它可能促进某些含有ARE的mRNA的衰变（Chen et al.，2001）。KSRP最初被确定为在内含子c-src神经元特异性剪接增强子上组装的蛋白质复合物的组成部分(Min等人，1997）。它包含四个RNA结合K同源（KH）基序。这些基序对于这些RNA结合蛋白（RBP）的功能至关重要，因为它们内部的突变会导致苍蝇、蠕虫和哺乳动物的疾病或分化缺陷（Adinolfi等，1999）。然而，KH基序对特定RNA结合的贡献以及它们在给定RBP中的作用尚不清楚。可以想象，这些基序可能是协同RNA结合所必需的。也有可能KH基序参与了RBP功能所必需的蛋白质相互作用。
了解控制mRNA衰变的机制需要识别相关的酶机制。在酿酒酵母中，存在两种mRNA衰减途径（Tucker和Parker，2000）。这两种途径最初都涉及多聚(A)缩短。然后mRNA在5'到3’或3'到-5'方向被降解。在5'到3’的衰变途径中，下一步是通过Dcp1p/Dcp2p去壳酶从GpppN帽中去除7GDP，然后通过5'到3’外切酶Xrn1p快速降解转录本（Tucker和Parker，2000）。在3’到5’衰变途径中，mRNA被细胞质外泌体快速降解（Jacobs等，1998），这是一种包含至少9种外核糖核酸酶的复合物（Mitchell等，1997）。哺乳动物mRNA衰减的第一步似乎也是多聚(A)缩短（Shyu et al.，1991）。然而，哺乳动物mRNA衰变的机制步骤并不像酵母中那样明确。体外RNA衰减系统的使用提供了证据，证明3'-5’降解是由哺乳动物外泌体介导的，这代表了含ARE mRNA的主要衰变途径（陈等人，2001；王和基利德简，2001；慕克吉等人，2002)。哺乳动物外泌体很可能通过AREs被招募到固有的不稳定mRNA中。慕克吉等人认为，人类外泌体的一个核心亚基与AREs特异性结合，这种结合导致了ARE定向衰变（慕克吉等人，2002年）。然而，我们发现一些ARE-bp，包括KSRP，在物理上与外泌体相关，并且分离的外泌体优先降解含有ARE的RNA（Chen等，2001）。因此，我们认为外泌体通过与不稳定的ARE-BP的相互作用被招募到固有不稳定的mRNA底物上，这种招募提供了基本机制，负责包含ARE的mRNA快速和优先衰变（Chen等人，2001；Shim和Karin，2002）。
为了进一步了解不稳定的ARE-BP促进mRNA衰减的机制，并找到支持或反对该模型的证据，我们研究了KSRP在ARE导向的mRNA衰减中的作用。我们发现，在体内和体外，几种含ARE的mRNA的快速衰变都需要KSRP。我们所需的功能域KSRP促进mRNA衰变，发现最小的活跃区域是由第三和第四KH基序，一起介导与ARE高亲和性结合，而第三KH基序单独负责与聚(A)核糖核酸酶（PARN）和外泌体相互作用。另外的实验表明，KSRP促进含ARE mRNA快速衰变的能力依赖于其结合ARE和招募降解机制的能力，从而为招募模型提供了强有力的支持。我们还检测到个体ARE-bp相对重要性的细胞类型特异性偏倚。在HeLa细胞中，去除KSRP而不是BRF1，减少了ARE定向mRNA的衰减，而去除BRF1，而不是KSRP，可以抑制HT1080细胞中含有ARE的mRNA的衰减。尽管如此，同时抑制这两个因素导致了ARE的加性稳定。在两种细胞类型中都含有mRNA。
讨论
KSRP是ARE定向mRNA衰减的重要因素
上述结果表明，在体内和体外，某些含ARE mRNA的快速衰变需要KSRP。在这两个系统中，KSRP的消耗会导致一些包含ARE的mRNA的稳定。在Jurkat、HeLa和HT1080细胞中，在KSRP耗尽的S100中观察到稳定（图1）。此外，使用3' UTR中含有各种AREs的异源CAT mRNA，抑制KSRP的表达会抑制活细胞中包含所有三种AREs的mRNA的快速衰减（图2和3）。尽管KSRP在促进ARE定向mRNA衰变中的相对重要性可能取决于细胞类型和其他促进衰变的ARE-BPs或检测的特定mRNA物种的相对表达水平（如图7所示），KSRP功能的机制分析为定向mRNA周转的机制提供了重要的新见解。虽然在瞬时转染实验中，KSRP促进含有I类、Il或III类AREs的报告mRNA的衰变，但仍有待确定哪些内源性含ARE的mRNA在KSRP耗尽的细胞中最有效地稳定仍有待确定。然而ARE是mRNA快速周转的主要决定因素，额外的顺式元件也可以促进mRNA的衰变。这些额外的不稳定元素经常与AREs一起出现（Shyu等人，1991；智慧和李，1991；布朗等人，1996；斯托克林等人，2003），但不太可能被ARE-BP识别，如KSRP，有趣的是，只有少数含ARE的mRNA被发现在TP敲除小鼠中稳定（黑剪切，2002)。因此，一个个体的ARE-BP，如KSRP，可能只对包含ARE的mRNA的一个子集是最关键的，在没有它的情况下，其他ARE-BP，如果表达水平足够，可能会接管。事实上，我们发现HT1080细胞中KSRP的缺失只导致含有ARE的mRNA的部分稳定，而BRF1和KSRP表达的减少导致mRNA稳定性的加性增加。这种冗余表明，不同的促进衰变的ARE-bp可能通过类似的机制发挥作用，尽管它们的结构多样性。事实上，我们发现了一些促进衰变的ARE-bp，包括KSRP、TTP和AUF1，与外泌体共纯化（Chen等，2001）。正如下面所讨论的，这种交互很可能是它们功能的一个关键特性。
KSRP是RNA结合蛋白KH结构域家族的一员。它的中心核心包含四个相邻的KH基序。我们发现KSRP的中心KH结构域可以识别ARE，与外泌体和PARN相互作用，促进含有ARE的RNA的快速衰变。中央KH结构域两侧的N端和C端序列对于这三种活动都是不可或缺的，它们的功能作用目前尚不清楚，尽管它们可能需要KSRP介导的pre-mRNA剪接（Min et al.，1997）或适当的亚细胞定位。使用含有单个KH基序的重组蛋白，单独或组合，发现KH34以高亲和力识别ARE。由于缺乏KH4的KH基序组合不能有效地结合ARE，我们认为KH4主要负责ARE的结合，尽管需要一个额外的KH基序来稳定KH4-ARE相互作用。然而，高亲和力的ARE结合并不足以促进mRNA的快速衰变。这种活性还依赖于与参与mRNA降解的酶机制的相互作用。在GST下拉和共免疫沉淀实验中，KH3对于与外泌体和PARN的关联是必要和充分的。KH1-4和KH34足以在体外和体内促进定向mRNA衰变，而缺乏KH3或KH4的KH基序组合不具备这样的活性，重要的是，可以与外泌体和PARN相互作用但不能与ARE结合的KH3的超表达，对KSRP促进快速mRNA衰变能力施加显性负效应的。虽然目前尚不清楚KSRP是否可以直接与外泌体或PARN相互作用，或者这些相互作用是否依赖于其他因素，但我们认为KH3与外泌体和PARN相关联的能力是KSRP促进衰变活性的关键，因为：(1)在体外衰变系统中，外泌体是mRNA快速衰变所必需的（陈等人，2001；慕克吉等人，2002)，而PARN是去烯化所必需的（高等人，2000）。(2) KH124与ARE相互作用，但不能与外泌体和PARN结合，不能促进mRNA的快速衰减；(3)KH3的过表达干扰了KSRP促进RNA快速衰减的能力。
ARE定向mRNA衰减的招募模型
尽管对ARE和ARE-bp调节mRNA衰减的机制进行了深入的研究，但ARE和ARE-bp调节mRNA衰减的机制迄今尚未被很好地了解。例如，目前还不清楚AREs是如何同时促进多聚(A)缩短、5'去帽和mRNA体全体一起衰变的。上述和其他地方的最新发现为ARE定向mRNA衰减的机制提供了新的线索。最近发现TTP可以通过PARN促进含有ARE的mRNA的去烯化（Lai等，2003），我们的研究结果表明KSRP与PARN和外泌体都有关联。这些结果有力地支持了一个招募模型，该模型解释了某些ARE-bp如何促进含有ARE的mRNA的快速衰变。根据这个模型，某些ARE-bp，如KSRP、TTP或BRF1，与ARE结合，然后招募PARN和外泌体到包含ARE的mRNA附近，促进mRNA体的去烯化和降解。我们的结果表明，KSRP可以同时与PARN和外泌体相互作用。因此，KSRP对这两种因子的募集可能同时发生或几乎没有延迟，但直到去烯化发生，外泌体可能无法访问其底物。ARE-bp也可能招募脱壳酶和5'到3’外切酶，通过5'到3’衰变途径促进mRNA的衰变。ARE导向的mRNA衰减的招募模型与最近的发现一致，即Upf NMD因子招募脱壳酶、5'到3’外切酶、外泌体和PARN来降解哺乳动物细胞中含有无意义的mRNA（勒琼等人，2003)。因此，衰变促进因子最重要的功能是识别RNA上特定的顺式元件的能力，如ARE，进而增加RNA降解酶的局部浓度。
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