Roberto Gherzi, Kyung-Yeol Lee, Paola Briata, Daniel Wegmüller, Christoph Moroni, Michael Karin, Ching-Yi Chen
Molecular cell 2004 Jun 04;14(5):571-83 doi:10.1016/j.molcel.2004.05.002
PMID:15175153
固有的不稳定mRNA在其3' UTR中包含富AU元件(AREs),通过与ARE结合蛋白(ARE-BPs)相互作用作为mRNA稳定性决定因素。ARE和ARE-BP相互作用促进mRNA衰减的机制尚不完全清楚。在这里,我们证明了KSRP,一个包含KH结构域的ARE-BP,是ARE导向的mRNA衰减的必要因素。KSRP的一些KH基序(KHs)直接介导RNA结合、mRNA衰减以及与#外泌体 和聚(A)核糖核酸酶(PARN)的相互作用。KHs促进mRNA衰变的能力与它们与ARE结合并与RNA降解酶相关联的能力相关。因此,KHs通过招募含有ARE的mRNA的降解机制来促进mRNA的快速衰变。
哺乳动物mRNA衰减的第一步似乎也是多聚(A)缩短(Shyu et al.,1991)。然而,哺乳动物mRNA衰减的机制步骤并不像酵母中那样明确。体外RNA衰减系统的使用提供了证据,表明3’到5’降解是由哺乳动物#外泌体 介导的,这代表了含有ARE的mRNA的主要衰减途径(Chen等人,2001;王和基尔德建,2001;慕克吉等人,2002)。哺乳动物外泌体很可能通过AREs被招募到固有的不稳定mRNA中。Mukherjee等人认为,人类外泌体的一个核心亚基与AREs特异性结合,这种结合负责ARE定向衰变(慕克吉等人,2002年)。然而,我们发现一些ARE-BP,包括KSRP,在物理上与外泌体相关,并且分离的外泌体优先降解含有ARE的RNA(Chen等,2001)。因此,我们认为外泌体通过与不稳定的ARE-BP的相互作用被招募到固有不稳定的mRNA底物上,这种招募提供了包含ARE的mRNA快速和优先衰变的基本机制(Chen等人,2001;Shim和Karin,2002)。
不同mRNA种类的mRNA稳定性差异很大,在决定基因表达水平方面起着重要作用(古哈尼约吉和布鲁尔,2001;Wilusz等人,2001)。不同的mRNA衰减率是由mRNA分子中特定的顺式作用元件决定的。哺乳动物细胞中最常见的导致mRNA快速衰变的顺式元件是富AU元件(ARE),存在于短寿命细胞因子和原癌基因mRNA的3' UTR内(Chen和Shy,1995;Bakheet等人,2001)。最近对3' UTR的计算分析显示,多达8%的人类mRNA含有AREs(Bakheet等人,2001年)。这一发现表明AREs可能是大多数不稳定mRNA降解的原因。
AREs根据其序列特征和衰减特征分为三类(Chen等人,1995;Peng等人,1996)。I类AREs包含1到3个分散的五核苷酸AUUUA拷贝,嵌在富U区,在c-fos和c-myc mRNA中发现。Il类AREs包含AUUUA基序的多个重叠拷贝,仅在细胞因子mRNA中发现。III类AREs,如c-jun mRNA中的AREs,缺乏标志性的AUUUA,但包含一个富U序列。AREs介导的mRNA衰减的特征是mRNA体的快速多聚(A)缩短和快速衰变(Chen等人,1995;Peng等人,1996;Xu等人,1997)。除AREs外,还描述了几种不含ARE的不稳定元件。茎环不稳定元件(SLDE)包含在粒细胞集落刺激因子mRNA的3' UTR中发现的两个预测的茎环结构(Brown et al.,1996)。另一种通过ARE独立途径促进TNFα mRNA衰减的顺式元件最近被描述(斯托克林等,2003)。
许多蛋白质被描述为与AREs结合(彭等人,1998年;贝维拉奎等人,2003年)。然而,这些RNA蛋白相互作用的功能和生理意义以及它们在ARE导向的mRNA衰减中的确切作用仍然是一个谜。AUF1促进mRNA的衰变,并参与热休克诱导的含ARE mRNA的稳定(Wilson和Brewer,1999;Sarkar等人,2003)。TTP与TNFα和其他细胞因子mRNA的AREs结合,促进它们的去烯化和衰变。缺乏TTP的小鼠表现出TNFα和GM-CSF mRNA周转减少(黑剪切,2002)。BRF1是TTP的近亲,也促进ARE导向的mRNA衰减(斯托克林等,2002)。相比之下,HuR稳定含有ARE的mRNA(彭等人,1998;布伦南和斯泰茨,2001)。
尽管进行了深入的研究,ARE-bp调节mRNA衰减的机制仍然不清楚。此外,由于ARE序列的多样性(Bakheet et al.,2001),很可能存在额外的ARE-bp。事实上,我们之前纯化了一种新的ARE-BP,KSRP(K同源剪接调节蛋白),并认为它可能促进某些含有ARE的mRNA的衰变(Chen et al.,2001)。KSRP最初被确定为在内含子c-src神经元特异性剪接增强子上组装的蛋白质复合物的组成部分(Min等人,1997)。它包含四个RNA结合K同源(KH)基序。这些基序对于这些RNA结合蛋白(RBP)的功能至关重要,因为它们内部的突变会导致苍蝇、蠕虫和哺乳动物的疾病或分化缺陷(Adinolfi等,1999)。然而,KH基序对特定RNA结合的贡献以及它们在给定RBP中的作用尚不清楚。可以想象,这些基序可能是协同RNA结合所必需的。也有可能KH基序参与了RBP功能所必需的蛋白质相互作用。
了解控制mRNA衰变的机制需要识别相关的酶机制。在酿酒酵母中,存在两种mRNA衰减途径(Tucker和Parker,2000)。这两种途径最初都涉及多聚(A)缩短。然后mRNA在5'到3’或3'到-5'方向被降解。在5'到3’的衰变途径中,下一步是通过Dcp1p/Dcp2p去壳酶从GpppN帽中去除7GDP,然后通过5'到3’外切酶Xrn1p快速降解转录本(Tucker和Parker,2000)。在3’到5’衰变途径中,mRNA被细胞质外泌体快速降解(Jacobs等,1998),这是一种包含至少9种外核糖核酸酶的复合物(Mitchell等,1997)。哺乳动物mRNA衰减的第一步似乎也是多聚(A)缩短(Shyu et al.,1991)。然而,哺乳动物mRNA衰变的机制步骤并不像酵母中那样明确。体外RNA衰减系统的使用提供了证据,证明3'-5’降解是由哺乳动物外泌体介导的,这代表了含ARE mRNA的主要衰变途径(陈等人,2001;王和基利德简,2001;慕克吉等人,2002)。哺乳动物外泌体很可能通过AREs被招募到固有的不稳定mRNA中。慕克吉等人认为,人类外泌体的一个核心亚基与AREs特异性结合,这种结合导致了ARE定向衰变(慕克吉等人,2002年)。然而,我们发现一些ARE-bp,包括KSRP,在物理上与外泌体相关,并且分离的外泌体优先降解含有ARE的RNA(Chen等,2001)。因此,我们认为外泌体通过与不稳定的ARE-BP的相互作用被招募到固有不稳定的mRNA底物上,这种招募提供了基本机制,负责包含ARE的mRNA快速和优先衰变(Chen等人,2001;Shim和Karin,2002)。
为了进一步了解不稳定的ARE-BP促进mRNA衰减的机制,并找到支持或反对该模型的证据,我们研究了KSRP在ARE导向的mRNA衰减中的作用。我们发现,在体内和体外,几种含ARE的mRNA的快速衰变都需要KSRP。我们所需的功能域KSRP促进mRNA衰变,发现最小的活跃区域是由第三和第四KH基序,一起介导与ARE高亲和性结合,而第三KH基序单独负责与聚(A)核糖核酸酶(PARN)和外泌体相互作用。另外的实验表明,KSRP促进含ARE mRNA快速衰变的能力依赖于其结合ARE和招募降解机制的能力,从而为招募模型提供了强有力的支持。我们还检测到个体ARE-bp相对重要性的细胞类型特异性偏倚。在HeLa细胞中,去除KSRP而不是BRF1,减少了ARE定向mRNA的衰减,而去除BRF1,而不是KSRP,可以抑制HT1080细胞中含有ARE的mRNA的衰减。尽管如此,同时抑制这两个因素导致了ARE的加性稳定。在两种细胞类型中都含有mRNA。
讨论
KSRP是ARE定向mRNA衰减的重要因素
上述结果表明,在体内和体外,某些含ARE mRNA的快速衰变需要KSRP。在这两个系统中,KSRP的消耗会导致一些包含ARE的mRNA的稳定。在Jurkat、HeLa和HT1080细胞中,在KSRP耗尽的S100中观察到稳定(图1)。此外,使用3' UTR中含有各种AREs的异源CAT mRNA,抑制KSRP的表达会抑制活细胞中包含所有三种AREs的mRNA的快速衰减(图2和3)。尽管KSRP在促进ARE定向mRNA衰变中的相对重要性可能取决于细胞类型和其他促进衰变的ARE-BPs或检测的特定mRNA物种的相对表达水平(如图7所示),KSRP功能的机制分析为定向mRNA周转的机制提供了重要的新见解。虽然在瞬时转染实验中,KSRP促进含有I类、Il或III类AREs的报告mRNA的衰变,但仍有待确定哪些内源性含ARE的mRNA在KSRP耗尽的细胞中最有效地稳定仍有待确定。然而ARE是mRNA快速周转的主要决定因素,额外的顺式元件也可以促进mRNA的衰变。这些额外的不稳定元素经常与AREs一起出现(Shyu等人,1991;智慧和李,1991;布朗等人,1996;斯托克林等人,2003),但不太可能被ARE-BP识别,如KSRP,有趣的是,只有少数含ARE的mRNA被发现在TP敲除小鼠中稳定(黑剪切,2002)。因此,一个个体的ARE-BP,如KSRP,可能只对包含ARE的mRNA的一个子集是最关键的,在没有它的情况下,其他ARE-BP,如果表达水平足够,可能会接管。事实上,我们发现HT1080细胞中KSRP的缺失只导致含有ARE的mRNA的部分稳定,而BRF1和KSRP表达的减少导致mRNA稳定性的加性增加。这种冗余表明,不同的促进衰变的ARE-bp可能通过类似的机制发挥作用,尽管它们的结构多样性。事实上,我们发现了一些促进衰变的ARE-bp,包括KSRP、TTP和AUF1,与外泌体共纯化(Chen等,2001)。正如下面所讨论的,这种交互很可能是它们功能的一个关键特性。
KSRP是RNA结合蛋白KH结构域家族的一员。它的中心核心包含四个相邻的KH基序。我们发现KSRP的中心KH结构域可以识别ARE,与外泌体和PARN相互作用,促进含有ARE的RNA的快速衰变。中央KH结构域两侧的N端和C端序列对于这三种活动都是不可或缺的,它们的功能作用目前尚不清楚,尽管它们可能需要KSRP介导的pre-mRNA剪接(Min et al.,1997)或适当的亚细胞定位。使用含有单个KH基序的重组蛋白,单独或组合,发现KH34以高亲和力识别ARE。由于缺乏KH4的KH基序组合不能有效地结合ARE,我们认为KH4主要负责ARE的结合,尽管需要一个额外的KH基序来稳定KH4-ARE相互作用。然而,高亲和力的ARE结合并不足以促进mRNA的快速衰变。这种活性还依赖于与参与mRNA降解的酶机制的相互作用。在GST下拉和共免疫沉淀实验中,KH3对于与外泌体和PARN的关联是必要和充分的。KH1-4和KH34足以在体外和体内促进定向mRNA衰变,而缺乏KH3或KH4的KH基序组合不具备这样的活性,重要的是,可以与外泌体和PARN相互作用但不能与ARE结合的KH3的超表达,对KSRP促进快速mRNA衰变能力施加显性负效应的。虽然目前尚不清楚KSRP是否可以直接与外泌体或PARN相互作用,或者这些相互作用是否依赖于其他因素,但我们认为KH3与外泌体和PARN相关联的能力是KSRP促进衰变活性的关键,因为:(1)在体外衰变系统中,外泌体是mRNA快速衰变所必需的(陈等人,2001;慕克吉等人,2002),而PARN是去烯化所必需的(高等人,2000)。(2) KH124与ARE相互作用,但不能与外泌体和PARN结合,不能促进mRNA的快速衰减;(3)KH3的过表达干扰了KSRP促进RNA快速衰减的能力。
ARE定向mRNA衰减的招募模型
尽管对ARE和ARE-bp调节mRNA衰减的机制进行了深入的研究,但ARE和ARE-bp调节mRNA衰减的机制迄今尚未被很好地了解。例如,目前还不清楚AREs是如何同时促进多聚(A)缩短、5'去帽和mRNA体全体一起衰变的。上述和其他地方的最新发现为ARE定向mRNA衰减的机制提供了新的线索。最近发现TTP可以通过PARN促进含有ARE的mRNA的去烯化(Lai等,2003),我们的研究结果表明KSRP与PARN和外泌体都有关联。这些结果有力地支持了一个招募模型,该模型解释了某些ARE-bp如何促进含有ARE的mRNA的快速衰变。根据这个模型,某些ARE-bp,如KSRP、TTP或BRF1,与ARE结合,然后招募PARN和外泌体到包含ARE的mRNA附近,促进mRNA体的去烯化和降解。我们的结果表明,KSRP可以同时与PARN和外泌体相互作用。因此,KSRP对这两种因子的募集可能同时发生或几乎没有延迟,但直到去烯化发生,外泌体可能无法访问其底物。ARE-bp也可能招募脱壳酶和5'到3’外切酶,通过5'到3’衰变途径促进mRNA的衰变。ARE导向的mRNA衰减的招募模型与最近的发现一致,即Upf NMD因子招募脱壳酶、5'到3’外切酶、外泌体和PARN来降解哺乳动物细胞中含有无意义的mRNA(勒琼等人,2003)。因此,衰变促进因子最重要的功能是识别RNA上特定的顺式元件的能力,如ARE,进而增加RNA降解酶的局部浓度。
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