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基础医学在读研究僧
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CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR/Cas9迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手。
成簇的规律性间隔的短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR），是在细菌中发现的有规律成簇又带间隔的短回文序列，可以帮助细菌抵抗噬菌体的入侵，是细菌针对噬菌体的获得性免疫。CRISPR序列由众多短而保守的重复序列（repeat）和间隔序列（spacer）组成。重复序列含有回文序列，可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，他们是被细菌俘获的外源DNA序列，当这些外源遗传物质再次入侵时，CRISPR/Cas系统就会予以精确打击。在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。另外，上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRIPSR序列区域共同发生作用，因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPR associated, Cas）。Cas基因与CRIPSR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。
CRISPR位点结构图
CRIPSR/Cas系统进行基因编辑的过程可以分为三个阶段。第一阶段：宿主细菌俘获外源DNA，当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌时，噬菌体将其双链DNA注入到细胞内部。Cas1和Cas2编码的蛋白会扫描这段外源DNA，并识别出原间隔序列临近基序（protospacer adjacent motif, PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基），而且PAM两端延伸的几个碱基都十分保守。Cas1/2蛋白复合物会将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列，然后将原间隔序列从外源DNA上剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游，然后DNA进行修复，将打开的双链缺口闭合，使得一段新的间隔序列被添加到基因组的CRISPR序列之中。
俘获外源DNA
第二阶段是合成crRNA。根据Case蛋白的类型，可以将CRISPR/Cas系统分为三种类型，CRISPR/Cas9系统属于Type II，是目前最成熟也是应用最广泛的类型。当外来的病毒或噬菌体再次入侵时，CRIPSR序列会在前导区的调控下转录出pre-CRIPSR-derived RNA（pre-crRNA），同时与pre-crRNA序列互补的trans-acting crRNA（tracrRNA）也会被转录出来。其中tracrRNA是由重复序列区转录而成的具有发卡结构的RNA，而pre-crRNA是由整个CRISPR序列转录而成的大型RNA分子，也是crRNA的前体。之后pre-crRNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。这个复合体会根据入侵者的类型，选取与之对应的间隔序列RNA，并在核糖核酸酶III（RNaseIII）的协助下对这段间隔序列RNA进行剪切，最终形成一段小的crRNA，然后tracrRNA，Cas9蛋白与crRNA组成最终的复合物。
crRNA合成
第三阶段是靶向干扰，由tracrRNA，Cas9蛋白和crRNA组成的最终复合物会对再次入侵的整个外源DNA进行扫描，并识别出于crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM和原间隔序列的区域，DNA双链被解开，形成R-Loop。crRNA将与互补链杂交，另一条链则呈现游离状态。接着Cas9蛋白精确的平端切割位于PAM上游的3个核苷酸位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（Double strain break, DSB），外源的双链DNA被剪切开，基因沉默。
靶向干扰
CRISPR/Cas9系统应用于基因敲除的原理是，tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA（即sgRNA）时用来指导Cas9作用。针对目的基因，通过人工设计的sgRNA（small guide RNA, sgRNA）来识别目的基因序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成DNA的双链断裂。在通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（Non-homologous End Joining, NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。
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