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冠状病毒（Cov）是一种大型包膜非分段正链RNA病毒，广泛分布于人类和其他动物物种，包括蝙蝠、老鼠和鸟类。SARS-CoV-2感染可导致疾病，称为2019新型冠状病毒病（COVID-19）。COVID-19的症状从轻微症状到严重呼吸综合征，包括肺炎，甚至死亡（陈等，2020b；江和石，2020；夏等，2020)。到目前为止，新冠肺炎疫情已报告造成超过135.3万例确诊病例，并已被世界卫生组织宣布为全球突发公共卫生事件。 RNAi是一种转录后基因沉默机制，在所有真核生物中进化保守，在包括哺乳动物在内的多种真核生物中被认为是一种细胞内的抗病毒免疫防御机制（Ding et al.，2018）。在抗病毒RNAi中，病毒感染和复制产生病毒来源的dsRNA（vi-dsRNA），可被宿主核糖核酸内切酶Dicer识别并切割成病毒来源的siRNAs（vsiRNAs）。这些vsiRNAs被整合到RNA诱导沉默复合体（RISC）中的Argonaute蛋白中，以序列特异性的方式指导感染细胞中同源病毒RNA的破坏。作为对策，病毒编码RNAi的病毒抑制子（VSRs），在不同的步骤拮抗RNAi通路。例如，甲型流感病毒（IAV）NS1、人肠道病毒A71（EV-A71）3A和登革病毒2（DENV2）NS2A已被确定为VSRs，在病毒感染的背景下抑制vsiRNA的产生和抗病毒RNAi反应（Qiu等人，2020；Ding等人，2018）。因此，了解SARS-CoV-2如何与抗病毒RNAi相互作用，对于更好地了解这种新型冠状病毒具有重要意义，并可能有助于控制感染的传播和开发有效的治疗方法。此前有研究报道，通过细胞沉默逆转试验，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）核衣壳(N)蛋白在哺乳动物细胞中显示出VSR活性（Cui et al.，2015）。鉴于冠状病毒N蛋白之间氨基酸序列的高同源性（94%）（支持信息图S1），研究SARS-CoV -2 N是否也具有VSR活性是很有趣的。因此，在本研究中，我们评估了SARS-CoV-2 N在培养的人类细胞中抑制RNAi的作用。
我们首先通过经典的逆转沉默实验检测了SARS-CoV-2 N是否具有VSR活性，该实验将增强的绿色荧光蛋白（EGFP）特异性shRNA与编码SARS-CoV-2 N蛋白的质粒一起转染到表达EGFP的293T细胞中。转染后48h（hpt），通过荧光显微镜和蛋白印迹检测EGFP蛋白水平。EGFP特异性shRNA表达导致EGFP蛋白水平较低（图1A，面板“Vec”；图1B，lane 2），证实了shRNA在该RNAi系统中的效率。我们的数据显示，SARS-CoV-2 N的表达显著恢复了EGFP的蛋白水平（图1A，面板“N”；图1B，lane 3），表明SARS-CoV-2 N在细胞中显示了VSR活性。值得注意的是，埃博拉病毒（EBOV）VP35的异位表达，一种特征良好的VSR，如预期的那样抑制了shRNA诱导的RNAi（图1B，lane 4）。
由于RNAi直接导致靶mRNA的切割和降解，我们使用针对EGFP ORF1-400nt的地高辛（DIG）标记的RNA探针，使用逆转沉默系统进一步检测了SARS-CoV-2 N的VSR活性。我们的结果显示，SARS-CoV-2 N显著恢复了293T细胞的EGFP mRNA水平（图1C）。总之，我们的数据显示，SARS-CoV-2 N蛋白在培养的人类细胞中具有VSR活性。
在确定了SARS-CoV-2 N含有VSR活性后，我们试图研究SARS-CoV-2 N拮抗RNAi的机制。在dsRNA/shRNA诱导的RNAi过程中，dsRNA/shRNA最初被Dicer识别并切割成siRNA。因此，我们通过RNA-IP检测SARS-CoV-2 N是否可以隔离dsRNA。简而言之，将表达flag标记N或空载体的293T细胞与EGFP特异性dsRNA（EGFP ORF1-200nt）一起裂解，并分别与抗flag或小鼠IgG抗体免疫沉淀。从RNA-IP沉淀中提取的RNA，然后使用针对EGFP的1-200nt dsRNA的RNA探针进行北方印迹检测。我们的研究结果显示，SARS-CoV-2 N确实与293T细胞中的dsRNA相关（图1D），这意味着SARS-CoV-2 N抑制RNAi的机制是将dsRNA隔离在细胞中，这可能阻止了Dicer对病毒dsRNA的识别和切割。在RNAi过程中，需要Dicer切割的siRNAs组装siRNAs合并的RISC来指导同源RNA的降解，这是RNAi的效应步骤（Ding等，2018）。
在确定SARS-CoV-2 N可以与dsRNA相关后，我们进一步研究了SARS-CoV-2 N是否也能抑制siRNA诱导的RNAi。为此，我们将SARS-CoV-2 N表达载体和化学合成的EGFP特异性siRNA共转染到表达EGFP的293T细胞中。通过荧光显微镜检测RNAi的作用（图1E），蛋白质印迹法检测EGFP蛋白表达（图1F），或通过北方印迹检测EGFP mRNA水平（图1G）。EGFP特异性siRNA降低了EGFP的蛋白和mRNA水平，而SARS-CoV-2 N的异位表达有效地恢复了EGFP在蛋白和mRNA水平上的表达（图1F和G）。EBOV VP35作为阳性对照（图1F和G）。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2 N可以抑制siRNA诱导的细胞RNAi（抑制siRNA效率略低于抑制shRNA），这意味着SARS-CoV-2 N在效应步骤中也可以拮抗RNAi。本研究使用的方法和引物（表S1）见支持信息。
SARS-CoV-2疫情的出现在中国和全球范围内对人类健康造成了严重威胁和巨大的经济损失，促使我们尽快了解这种新型冠状病毒特征的各个方面。在本研究中，我们发现SARS-CoV-2编码的结构蛋白N在培养的人类细胞中显示出VSR活性。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2 N可以在起始阶段（即siRNA生物发生）和效应（即RISC组装和靶RNA裂解）中拮抗RNAi。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2 N可以拮抗shRNA或合成siRNA诱导的RNAi。RNAi在shRNA被Dicer加工成siRNA后启动，而siRNA诱导的RNAi需要合成的双siRNA组装成成熟的RISC效应复合物。SARS-CoV-2 N抑制细胞内RNAi的发现与之前观察到的SARS-CoV N也显示VSR活性一致（Cui et al.，2015），这意味着使用N蛋白作为VSR是冠状病毒拮抗抗病毒RNAi的常见策略。此外，对SARS-CoV N的VSR活性至关重要的Lys 258和Lys 262残基也保守在SARS-CoV-2的N蛋白中（支持信息图S1）。除了N蛋白外，之前的研究已经确定SARS-CoV 7a可以抑制哺乳动物细胞中的RNAi（Karjeetal.，2010），这表明冠状病毒可能通过编码多个VSRs来拮抗RNAi。考虑到SARS-CoV-2和SARS-CoV之间7a蛋白氨基酸序列的高度同源性，SARS-CoV-2 7a可能也含有VSR活性。编码多个VSRs可能为这些致病性病毒有效抑制RNAi提供额外的优势，突出了抗病毒RNAi对宿主细胞防御病毒感染的重要性。冠状病毒N蛋白含有非特异性RNA结合活性（Takeda et al.，2008）。在本研究中，我们还发现SARS-CoV-2 N可以与细胞中的dsRNA相关。我们的研究结果表明，SARS-CoV-2 N通过隔离dsRNA抑制RNAi，这与之前的研究结果一致，即冠状病毒N直接参与病毒RNA复制（Almazan et al.，2004）。此外，SARS-CoV N的RNA结合被证明对其拮抗干扰素诱导至关重要（Lu et al.，2011）。在病毒生命周期中，冠状病毒N蛋白包裹病毒基因组RNA以保护基因组，并与病毒基因组RNA共同进入宿主细胞，表明N对病毒RNA复制非常重要，特别是在起始阶段。综上所述，SARS-CoV-2在RNAi的起始和效应步骤中都可以作为细胞中的VSR，因此可能是SARS-CoV-2的一个关键免疫逃避因子，有助于这种新型冠状病毒的致病性。我们的研究及时扩展了我们对抗病毒RNAi免疫与SARS-CoV-2之间相互作用的认识，并可能有助于控制这种危险的病毒。
图1 SARS-CoV-2 N在培养的人类细胞中抑制RNAi。将编码EGFP的质粒（0.1µg）和EGFP特异性shRNA（0.3µg）的质粒，以及编码SARS-CoV-2 N或EBOV VP35的质粒（各2µg）共转染HEK293T细胞。a，48 hpt时，荧光显微镜观察细胞。比例尺，400µm。B，收集细胞裂解物，用抗EGFP、抗flag和抗微管蛋白抗体进行蛋白印迹分析。C，提取总RNA，用靶向EGFP ORF1-400nt的dig标记RNA探针检测EGFP mRNA水平。18S和28S RNAs作为加载对照。D，用编码SARS-CoV-2 N的质粒或空载体转染HEK293T细胞，以及EGFP特异性dsRNA。在24 hpt时，细胞裂解物被带有抗flag或抗IgG抗体的RNA-IP。分别用北方印迹法和西方印迹法检测输入和沉淀的RNA和蛋白质。将编码EGFP的质粒（0.1µg）和EGFP特异性siRNA（0.3µg）与空载体或编码SARS-CoV-2 N或EBOV VP35的质粒（各2µg）共转染HEK293T细胞。E，48 hpt时，荧光显微镜观察细胞。比例尺，400µm。F，收集细胞裂解物，用抗EGFP、抗flag和抗微管蛋白抗体进行蛋白印迹分析。G，提取总RNA，用北方印迹法检测EGFP mRNA水平。18S和28S RNAs作为加载对照。
原文：
SARS-CoV-2-encoded nucleocapsid protein acts as a viral suppressor of RNA interference in cells.
Jingfang Mu, Jiuyue Xu, Leike Zhang, Ting Shu, Di Wu, Muhan Huang, Yujie Ren, Xufang Li, Qing Geng, Yi Xu, Yang Qiu, Xi Zhou
Science China. Life sciences 2020 09;63(9):1413-1416 doi:10.1007/s11427-020-1692-1
PMID:32291557
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