自然杀伤 (NK) 细胞是一种特殊的免疫效应细胞类型，在针对异常细胞的免疫激活中起关键作用。与 T 细胞激活所需的事件不同，NK 细胞激活受 NK 受体与靶细胞的相互作用控制，独立于抗原加工和呈递。由于相对简单的激活线索，NK细胞在癌症免疫治疗领域获得了极大的关注。许多努力正在开发和设计基于 NK 细胞的癌症免疫疗法。
自然杀伤 (NK) 细胞是肿瘤免疫监视的重要组成部分，在小鼠模型和临床研究中，随着 NK 活性降低，癌症易感性和转移性更高，这证明了这一点。使用一系列生殖系编码的表面受体，NK 细胞能够识别恶性细胞并迅速对其采取行动，而无需事先致敏。激活后，NK 细胞释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，以与激活的细胞毒性 T 细胞类似的方式直接裂解肿瘤细胞。
NK 细胞也是趋化因子和细胞因子的有效生产者，例如干扰素 γ (IFN-γ) 和肿瘤坏死因子 α (TNF-α)，因此在调节适应性免疫反应中必不可少。由于它们具有消除肿瘤细胞的先天能力，基于 NK 细胞的癌症免疫疗法已被研究了数十年。早期临床试验已证明 NK 细胞输注的总体安全性，即使在同种异体环境中也是如此。
NK细胞的生物学功能
四十多年前，NK 细胞被鉴定为淋巴细胞，具有溶解肿瘤细胞的先天能力，无需事先致敏。NK 细胞可以通过释放含有颗粒酶和穿孔素的细胞毒性颗粒以及通过死亡受体介导的途径（例如 FasL/Fas）来触发靶细胞死亡。NK 细胞还通过分泌趋化因子和细胞因子发挥免疫调节功能，例如 RANTES 和 IFN-γ。
在人类中，传统上通过流式细胞术表征的 NK 细胞表面不存在 CD3 和存在 CD56 来识别 NK 细胞。在小鼠中，CD3 的缺乏和 NK1.1 的存在是区分 NK 细胞的典型标准。在缺乏 NK1.1 表达的小鼠品系（例如 BALB/c）中，CD49b 用于鉴定 NK 细胞。
自然杀伤 (NK) 细胞与癌细胞
天然细胞毒性受体 NKp46 也常用于在 CD3 表达缺失的情况下识别小鼠和人类 NK 细胞。值得注意的是，某些组织（如粘膜屏障）拥有最近发现的先天淋巴细胞 (ILC) 的子集，这些细胞也共享 NK 细胞的典型标志物。例如，分泌人类 ILC3 的 IL-22 子集是 CD56+NKp46+CD3。其他标记，例如缺少 c-kit，可用于区分人类 NK (c-kit-) 和 ILC3s (c-kit +)。在小鼠中，NK 和 ILC1 是 NK1.1+CD3-，但可以通过 CD49a 和 Eomes 表达进一步表征。NK 细胞是 CD49a-Eomes+，而 ILC1s 是 CD49a+Eomes。
NK 细胞存在于血液中，占循环淋巴细胞的 5%-15%，也存在于各种淋巴和非淋巴器官，如脾、肺和肝脏。根据外周血 NK 细胞的特征，人类 NK 细胞通常被细分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/− 和 CD56dimCD16+，传统上认为前者不太成熟并且是有效的细胞因子生产者，而后者更加成熟和最具细胞毒性。
血液中的大多数 NK 细胞是 CD56dim，而 CD56bright 亚群仅占总循环 NK 细胞的不到 15%。CD56bright 和 CD56dim NK 细胞在组织中的相对比例可能与在外周血中观察到的非常不同。值得注意的是，许多组织驻留的 NK 亚群现在被证明在表型和功能上与传统的外周血 NK 细胞不同。例如，在孕早期构成子宫内淋巴细胞的大部分的子宫 NK 细胞是 CD56 超亮细胞，通过调节胎盘血管重塑在妊娠中发挥重要作用。
NK 细胞来源于 CD34+ 造血干细胞。骨髓被认为是NK发育的主要部位。最近的证据表明，NK 细胞也可以在次级淋巴器官中发育和成熟，包括扁桃体、脾脏和淋巴结。NK 细胞祖细胞经历不同的发育阶段，逐渐获得定义 NK 细胞身份的表面受体的表达，如 NK1.1 和 CD56 和/或调节其效应子功能，如 CD16 和 NKp46。
基于NK细胞的癌症免疫疗法的临床研究
当前基于 NK 细胞疗法的临床前开发很大程度上受到早期临床研究的启发。随着对 NK 细胞如何被激活的了解，最初的基于 NK 细胞的疗法在造血干细胞移植 (HSCT) 的临床环境中处于领先地位，由此证明 NK 细胞具有发挥移植物抗白血病作用的能力。
研究表明，KIR 不匹配的同种异体反应性供体 NK 细胞保护骨髓移植的 AML 患者免于 AML 复发，同时避免移植物抗宿主病 (GVHD) 。在高剂量环磷酰胺和氟达拉滨的预处理方案后，输注来自 HLA 半相合供体的 NK 细胞结合皮下注射 IL-2 导致供体 NK 细胞在体内成功扩增并诱导 519 名预后不良的急性髓系白血病 (AML) 患者。进一步研究表明有效的淋巴去除预处理对体内 NK 细胞扩增和持久性的影响，因为接受较弱预处理的患者未能展示 NK 细胞植入。目前认为，过继转移的成功需要创造一个淋巴细胞减少的环境，为供体细胞的生存和增殖提供一个生态位。
CAR-NK细胞作为CAR-T疗法的替代品
配备 CAR 的 T 细胞已被证明可为患有特定液体癌症的患者提供临床益处。两种靶向 CD19 的 CAR-T 产品被 FDA 批准用于治疗 B 细胞淋巴瘤和急性淋巴细胞白血病（ALL）。然而，CAR-T 疗法有两个主要挑战：(i) 需要足够长的时间来产生治疗剂量的自体 CAR-T 细胞，这限制了其治疗快速进展疾病患者的可行性；(ii) 难以从大量预处理且经常淋巴细胞减少的癌症患者中获得足够数量的自体 T 细胞用于 CAR-T 细胞生成。
作为 CAR-T 细胞疗法的替代方案，CAR-NK 细胞疗法不仅可以规避这些挑战，而且还具有其他主要优势：(i) 能够使用无限的同种异体 NK 源而无需担心 GVHD [6, 31, 32]；(ii) 用 NK 细胞系或 iPSC-NK 产生“现成”产品的潜力 [37,38,39,40,41]；(iii) 生产时间相对缩短；iv) 通过独立于 CAR 工程的 NK 细胞天然受体识别和杀死肿瘤细胞，不太可能通过下调 CAR 抗原而使疾病逃脱，如 CAR-T 细胞疗法所示。
用于临床的 NK 扩增
保留细胞毒活性的 NK 细胞的来源和临床规模扩增是开发临床规模 NK 细胞疗法的主要挑战。目前，策略因临床环境和细胞来源而异。新鲜分离、活化或体外扩增的 NK 细胞群显示出表型和功能差异。差异还源于激活方法，例如白介素的选择、它们的组合、饲养细胞的类型以及其他一些因素。
供体来源的 NK 来源
供体NK细胞的主要来源是采集的外周血。在与细胞因子短暂孵育过夜后，使用同种异体 NK 进行无扩增的过继转移已被证明足以激活 NK 细胞并增强它们对肿瘤靶标的细胞毒性。然而，用于治疗的 NK 细胞的剂量是有限的。随着活化和扩增方法的改进，制备越来越高剂量的 NK 细胞用于从单供体静脉切开术进行过继转移变得可能。
为了避免严重的副作用，例如同种异体反应性 T 细胞引起的 GVHD或供体来源的 B 细胞引起的过客淋巴细胞综合征，建议在扩增前对同种异体 NK 细胞进行纯化以限制污染总 T细胞小于 1–5 × 105/Kg。NK 细胞的纯化通常通过 CD3 表达细胞的磁耗竭和随后 CD56 表达细胞的富集或通过荧光激活细胞分选来实现。
脐带血 (UCB)或胎盘代表了其他显着的 NK 细胞来源，已被用于临床应用。UCB 和胎盘衍生细胞都含有一定比例的 NK 细胞祖细胞，这些祖细胞能够在成熟和扩增阶段分化为 NK 细胞。通常，一剂 UCB 或胎盘供体可以消耗到足以进行一次过继转移程序的量。例如，胎盘分离 NK 的 21 天 NK 培养产生平均 1.2 × 109 个 NK 细胞，存活率约为 80% [106] 和 1.59 × 1010 个 NK 细胞，平均纯度为 92.37% 来自 UCB。
iPSC-NK 细胞来源
供体来源的 NK 细胞具有一定的局限性，主要是因为它们在功能能力和扩增潜力方面存在差异。在临床环境中，每个批次都需要验证，这会导致患者接受输注之前的额外延迟时间。此外，受限的扩增能力为通过基因工程提高 NK 细胞的功效带来了困难。CAR-NK 是开发中克服这一限制的方法之一。使用易于扩展至大剂量的改良NK细胞系CAR-NK92的方法已进入临床试验。然而，NK92 是一种转化细胞系，具有与其致瘤性质和细胞遗传学异常相关的局限性，因此临床使用需要辐照，这限制了其寿命活动。
一种新的 NK 细胞来源已经出现，以规避与 NK 细胞治疗相关的许多挑战。它是 iPSC 分化的 NK 细胞 (iPSC-NK)。从概念上讲，iPSC-NK 可以提供同质分化的 NK 细胞群，可以作为“现货供应”扩展到临床规模，克服 NK-92 细胞系的局限性。
几个小组已经证明了从人类胚胎干细胞 (hESCs) 和 iPSCs 体外衍生出功能性 NK 细胞。通常，分化是在胚状体中或通过 OP9 小鼠基质共培养诱导的。最近，还在贴壁单层培养物中建立了分化方法。贴壁条件的优势在于它为优化分化提供了明确的环境。与仅产生高达 4% 的 CD34+ 的其他方法相比，该方法实现了超过 15% 的 CD34+ 造血祖细胞。这项技术的出现为临床规模的 NK 细胞生产提供了一个全新的框架，允许在多能细胞状态下进行基因修饰和无限扩增。
CAR 改造的 iPSC-NK 细胞已经在临床前研究中证明其在靶向人类肿瘤方面的有效性 [41]。iPSC-NK 细胞技术的另一个重要特征是能够操纵分化策略，从而塑造所得产品的表型和功能。例如，用 GSK3b 抑制剂增强 Wnt 信号通路诱导最终造血在这种条件下发育的 NK 细胞具有更明显的炎性细胞因子产生表型，而 Wnt 独立的 NK 亚群，类似于原代胎儿 NK 细胞，形成了一个增加细胞毒性的偏见。这种改变分化过程的能力为探索 NK 细胞的常驻或器官特异性表型提供了可能。
诱导多能干细胞（iPSC）的高增殖能力允许引入各种遗传修饰和用于治疗一系列疾病的现成单倍型特异性细胞的开发资源库。有许多正在进行的使用工程化 iPSC-NK 细胞进行癌症免疫治疗的临床试验。
基于NK细胞的癌症治疗的临床开发
“现成” NK 细胞治疗产品 oNKord，来自 UCB-CD34+ 祖细胞的同种异体部分 HLA 匹配 NK 细胞，已获得 EMA 和 FDA 的孤儿药指定，用于治疗不符合同种异体干细胞移植资格的 AML 患者.该批准基于临床研究，证明 oNKord 在第 1 年将生存率提高了 80%，而对照组则为 35%。
近日，FDA 批准了使用胎盘扩增 NK 细胞（CYNK-001）治疗胶质母细胞瘤（GBM）的研究新药（IND）。这一成功鼓励了许多正在进行的基于 NK 细胞的癌症治疗的临床研究，单独或与其他方案相结合。Clinicaltrials.gov 目前列出了 100 多项基于 NK 细胞的癌症免疫疗法的临床试验。在此，我们重点介绍了当前对血液系统恶性肿瘤和实体瘤的评估。
基于 NK 细胞的血液系统恶性肿瘤临床试验
同种异体或自体供体来源的 NK 细胞疗法用于治疗血液系统恶性肿瘤（如 AML）的安全性和有效性已得到充分证实。随着不断努力改善治疗反应和产生更可行的 NK 细胞临床规模的新方法，正在设计新兴的临床试验来评估这些新模式并扩大其适应症。
在 3 名复发或难治性 AML 患者中对 CAR NK-92 细胞进行的首次人体临床试验表明，CAR NK-92 可以以每名患者高达 50 亿个细胞的剂量输注，而不会引起显着的不良反应 [149]。脐带血衍生的 CD19 靶向 CAR-NK 治疗复发或难治性 CD19+ 癌症患者的 I/II 期试验正在进行中 (NCT03056339)。中期结果显示，11 名患者中有 8 名对治疗有客观反应，而没有出现严重的毒性反应。
基于 NK 细胞的实体瘤临床试验
有大量关于 NK 细胞免疫疗法治疗实体瘤的临床试验。例如，正在进行一项 2 期临床试验，以评估人类 HLA 半相合造血细胞移植 (HCT) 以及移植后早期输注供体 NK 细胞 (NCT02100891) 的安全性和有效性。
研究对象为高危实体瘤患者，包括尤文肉瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤和中枢神经系统肿瘤。还有许多正在进行的临床试验正在评估靶向肿瘤的 CAR-NK 细胞的安全性和有效性，包括使用 HER2 特异性 CAR-NK 细胞治疗晚期或转移性 HER2 表达实体瘤（NCT04319757）、ROBO1 特异性 CAR-NK 细胞NK 细胞治疗广谱实体瘤 (NCT03940820)，以及 MUC1 特异性 CAR-pNK 治疗 MUC1 阳性复发或难治性实体瘤患者 (NCT02839954)。
MUC1 特异性 CAR-pNK 疗法在预防肿瘤复发和移植物抗宿主病方面表现出良好的安全性和初步疗效。有许多正在进行的临床试验正在探索基于 NK 的疗法与其他方式相结合的安全性和有效性。正在进行 I/II 期临床试验，以评估 NK 细胞联合尼妥珠单抗治疗晚期恶性肿瘤（NCT03554889）和 NK 细胞输注多线治疗后晚期恶性肿瘤患者的安全性和有效性（NCT03619954）。
结论
NK 细胞代表了一种专门的免疫效应细胞群，具有快速作用和有效的抗肿瘤能力。十年前，针对血液系统恶性肿瘤的开创性临床研究证实了过继性 NK 细胞癌症免疫疗法的概念。获得大量 NK 细胞、体外扩展到临床规模以及维持输注 NK 细胞的体内存活和活性的困难阻碍了进展。随着 iPSC-NK 和基因工程方法的新工具以及对 NK 细胞生物学的新理解，是时候重新探索 NK 细胞的治疗潜力了。尽管存在挑战，但目前已获批的基于 NK 细胞的疗法和新兴的临床前和临床研究吸引了人们的目光。
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