此前未知的冠状病毒引起的肺炎，仅用了8个月的时间就演化为影响空前深远的全球大流行病。已经发现的治疗措施为评估间充质干细胞及其细胞外囊泡 (EV)，尤其是外泌体的潜力提供了新的机会。那么干细胞或其外泌体：在新冠治疗中哪个更受青睐？
2020 年 2 月，世界卫生组织 (WHO) 确定冠状病毒 (SARS-CoV-2) 是导致 2019 年大流行性冠状病毒病 (COVID-19) 的罪魁祸首，感染 SARS-CoV-2 的患者会出现多种症状，从轻微的普通感冒到严重的急性呼吸系统疾病以及随后的死亡，尽管现在有几种有效的疫苗可用于对个人进行免疫，但每天都会发现有关 SARS-CoV-2 病毒的结构、致病性、传播系统和免疫特性的新事实，这促使世界各地的科学家继续研究所有可能的治疗策略来治疗感染人群。
另一种潜在的治疗方法是基于细胞的疗法。现在已经证明，间充质干细胞 (MSC) 在治疗肺损伤方面具有显着的治疗优势。
除了 MSCs 之外，不同的免疫细胞，如自然杀伤 (NK) 细胞、树突细胞 (DC)、T 细胞和细胞因子诱导的杀伤 (CIK) 细胞以及分泌的外泌体也已被评估，并发现它们具有有益的作用由传染性和非传染性病原体介导的肺部病理状况。
在各种细胞来源中，MSC 及其外泌体的治疗功能在不同的急性和慢性肺病模型中得到一致报道，这可以支持它们用于治疗 COVID-19 诱发的肺炎/ARDS 患者。
上海大学生命科学学院等研究团队在 2020 年 3 月的报告中首次证实了移植的 MSCs 在改善 COVID-19 患者肺功能方面的治疗潜力（下图）。
NHPBSC非造血外周血干细胞、MSC间充质干细胞、UC脐带、BM骨髓、NA不适用、鼻内、iv静脉、EV细胞外囊泡
近几十年来，MSCs 用于治疗不同阶段的呼吸系统疾病的候选资格导致其可能机制的揭示。例如，MSCs 的抗炎和抗凋亡作用通过诱导上皮细胞和内皮细胞的修复改善肺功能，并增强几种 ARDS 模型中肺泡水肿液的清除。MSC 能够分泌抗炎细胞因子（IL-10 和 TGF-β），导致中性粒细胞向受损器官募集减少，促炎细胞因子（TNF-α、IL-8、IL -6)。
这种功能（分泌抗炎剂）是 MSC 旁分泌活动的一部分，使它们能够管理周围细胞的功能，包括免疫细胞（巨噬细胞和 T 细胞）和非免疫细胞（肺泡上皮细胞）。此外，间充质干细胞通过转移线粒体直接与各种免疫细胞相互作用，从而避免它们的增殖以及将它们的表型改变为抗炎状态，直接通过隧道纳米管（TNT）或间接地通过分泌的细胞外囊泡。
MSCs分泌多种生长因子，包括成纤维细胞生长因子-β（FGFb）、血管内皮生长因子（VEGF），不仅能显着抑制细胞凋亡和减少氧化损伤，还能诱导细胞增殖和迁移。上皮和内皮细胞再生和替换肺纤维化中受损的细胞。这些特性可能对 COVID-19 患者的康复有用，分布肺泡通透性和过度中性粒细胞浸润一再被报道为 COVID-19 大流行的标志性病理生理学特性。
Angiopoietin-1 存在于分泌的可溶性因子 MSC 中，通过细胞骨架重组和预防肺泡上皮 II 型细胞中的 NF-κB 活性，改善肺泡屏障完整性并恢复炎症诱导的上皮蛋白通透性。
MSC 的作用机制人们普遍认为很大一部分是由旁分泌因子的分泌介导的。研究人员已经观察到 MSCs 旁分泌机制的工作作用，以帮助改善动物模型的气道炎症。由 MSC 分泌的可溶性介质包括细胞因子、生长因子、miRNA 以及外泌体，它们与亲本细胞具有相似的功能，决定了它们的特性。
与细胞对应物相比，外泌体的无毒性、低免疫原性、高稳定性、易于储存以及作为现成产品生产的潜力是外泌体的几大优势，这导致它们作为新的治疗替代品扩大了临床应用。
此外，外泌体的天然功能使它们能够通过质膜融合将其膜和细胞质生物活性成分从原始细胞递送至靶细胞。
还有其他独特的特性，包括自由穿越血脑屏障 (BBB) 等生物屏障的天然能力。此外，生物相容性是另一个特点。由于其源于生物来源和内在的靶向能力，外泌体已被用作临床前研究中药物成分的运载工具。
外泌体的这些独特特性增加了与 MSC 相关的免疫调节和抗炎作用，引入源自 MSC 的外泌体作为治疗干预的有趣工具，以应对当前的 COVID-19 大流行情况。MSC-外泌体可能与亲本细胞机制不同或相似，可以防止过度反应性免疫反应引起的细胞因子风暴，并促进损伤肺的内源性修复。
MSC-外泌体提到的三个功能包括抗炎特性、免疫调节和通过改变宿主细胞功能实现的组织保护特性。MSC-外泌体还具有由内源性货物产生的天然抗病毒活性，包括 mRNA 和 miRNA。
MSC-外泌体诱导的 T 调节细胞的免疫调节特性可能会增加感染甲型流感病毒 (IAV) 的新生小鼠中 TCD8 细胞的病毒清除率。曾有研究报道了 MSC-外泌体在猪流感病毒模型中的抗病毒活性。
他们表明，这种活性取决于 mRNA 和 miRNA 在源自 MSC 的外泌体中的存在以及它们向肺上皮细胞的转运。他们还在猪模型中证明了在 MSC 外泌体给药后通过避免促炎细胞因子和趋化因子的表达来减轻炎症。
此外，通过 MSC 外泌体诱导 T 调节细胞的表达可能会以未知机制增加 TCD8 细胞的病毒清除率。
MSC-外泌体的抗病毒能力可以在工程类型中得到提升，例如用于递送负载的抗病毒药物以及通过在其表面上表达抗体和受体作为纳米诱饵来生产工程外泌体。在纳米诱饵复合物中，外泌体充当细胞模拟物。通过与病毒结合，它们确实阻止了病毒进入宿主细胞的初始化，这是通过标记病毒来完成的，这要归功于物理连接，从而增加了感染前被免疫细胞清除的机会。例如，ACE2 存在于肺源性外泌体表面，可在感染前有效捕获病毒颗粒。
关于外泌体或细胞疗法哪个效果更好的争论仍然悬而未决。尽管具有几乎相同的治疗效果，但这两种策略中的任何一种都有其自身的优点和缺点，这些优点和缺点会影响治疗 COVID-19 患者的可行策略的选择。
1.外泌体功能与其源细胞的比较表明，外泌体能够通过不同或相似的机制发挥相同的作用，并且在许多情况下甚至更有效。例如，研究证实了 MSC 衍生的外泌体比原始细胞具有更好的免疫调节功能。因此，在一种可能不同于亲本细胞的机制中，MSC 衍生的外泌体改变了 PMSC Treg/Teff 比率，使 CD4 + CD25 + CD127low Tregs 增加，并且还改变了抗炎细胞因子的数量，包括 IL-10 增加。
2.由于体积小，外泌体能够穿过细静脉甚至血脑屏障，而间充质干细胞会立即被困在肺部并造成肺栓塞和梗塞，尤其是在静脉注射后。例如，静脉注射 inoxine 标记的 MSCs 表现出较高的初始摄取量，并且由于其相对较大的尺寸（悬浮液中≈ 25 μm），大量 MSCs 早期被困在肺中，影响其快速发挥作用。
3.由于其表面不存在 MHC I-II 类，同种异体和自体 MSC 衍生的外泌体都是安全的。在 2020 年 4 月的一项前瞻性非随机队列研究中，研究人员评估了来自同种异体 BMSC 的外泌体在 COVID-19 患者中的安全性和治疗效果。单次静脉注射外泌体 72 小时后，未观察到不良反应，并且满足了研究的所有安全终点。接受观察的 24 名患者中有 17 名 (71%) 康复。在临床上，患者恢复氧合的能力得到改善。实验室测试的结果还表明，通过增加中性粒细胞和淋巴细胞计数来重建免疫力，通过减少急性期反应物、C 反应蛋白和铁蛋白来抑制细胞因子风暴。除了这一发现，他们还报告说，MSC 衍生的外泌体是重症 COVID-19 的一种理想的新型治疗选择。如前所述，MSCs 的异常分化和自发转化仍然是一个问题。
4.取消外泌体参考[胚胎干细胞 (ESC) 和诱导多能干细胞 (iPS)] 的谱系等限制，结合根据 GMP 指南生产和冷冻保存临床级外泌体的开发技术，使它们的生产更容易，因此成本更低。例如，外泌体生产质量控制可以从第一步开始，即供体能力分析，随后在所有阶段实施。此外，一些生产过程，如最终浓缩和小瓶灌装，可以全自动方式进行，代表了闭环系统的一个例子。并对每个外泌体批次的最终产品进行大小、同质性、数量以及阳性和阴性标记的分析。
5.外泌体和工程外泌体的简单操作允许通过各种直接和间接技术生产范围广泛的针对预期目的定制的产品。也可以通过加载治疗药物来提高外泌体的治疗效果。
6.MSC-外泌体的另一个优势是，母细胞在治疗 COVID-19 时允许通过鼻腔给药载有抗病毒药物的外泌体，并将它们直接转移到最常接触冠状病毒的鼻粘膜和肺部，从而作为拟议药物有望有效发挥作用的目的地。
然而，基于外泌体的疗法的发展仍然存在一些障碍。
第一个挑战是找到满足治疗目标的合适细胞来源。组织来源、供体年龄和培养条件等各种因素也可能改变治疗特性，包括 MSC 的免疫调节和分化能力，诱导多能干细胞无限扩增的特点可能是这一解决的重要方向。
第二个问题是外泌体生产对细胞培养的整体依赖性。外泌体由细胞分泌。因此，大量生产它们需要在不损害其生产细胞的基因型和表型特性的情况下生产大量细胞。
在耗时更少且更具成本效益的过程中获得大量细胞是限制稳定产品的又一步。它肯定会限制大量生产携带细胞衍生外泌体的干细胞条件培养基。
然而，基于增加表面积技术的细胞培养开发的成功在很大程度上克服了这种限制。然而，控制表型改变风险和凋亡小体形成等环境参数的复杂性会降低最终产品的质量和数量。
由于外泌体是细胞的分泌产物，灌注生物反应器培养细胞，如中空纤维灌注生物反应器，在培养过程中提供了充分的传质，也提供了连续的高细胞密度培养，有效降低了细胞对血清因子的需求。Integra CELLine 系统是新型烧瓶“生物反应器”，能够将外泌体浓缩在膜室内，并允许长时间转移培养基。增加外泌体的浓度有效地减少了下游加工步骤，从而减少了由此产生的成本。
与大规模细胞培养系统中外泌体生产相关的另一个限制性问题是最佳细胞生长对动物血清的依赖性。这在两个方面是有问题的。第一个问题与病毒污染风险增加有关，而第二个问题涉及动物血清中大量存在的外泌体，如果在细胞培养前不去除，可能会进入最终产品并在注射前使其无法接受。另一种建议是无血清和无异种成分的培养基成分，但前提是它保持外泌体产品的可比治疗特性。
与贴壁生产细胞（如干细胞）相比，外泌体的一个显着优势是它们可以简单地从条件培养基中分离出来。然而，贴壁细胞产物通过酶促分离，这增加了下游加工操作成本和纯化时间，同时降低了效率，导致产品损失。
在下游加工中，通常使用四种分离方法来纯化外泌体，包括沉降力、亲和分离、过滤和聚合沉淀。由于不同的原因，这些方法中的每一种都可能不适用于外泌体的大规模生产。
例如，超速离心的过程冗长、步骤重复以及分离过程中外泌体的破坏等局限性是微不足道的。然而，对于纳米特异性沉淀，它不仅需要下游处理以从最终产品中去除 PEG，而且由于各种类型的 EV 和蛋白质的共分离，也会降低最终产品的纯度。
通过针对外泌体表面标记物的抗体进行亲和纯化可能是外泌体纯化的最佳方法，与其他方法相比，它可以产生更纯、更均一的产品。
所提出的外泌体纯化的理想工艺是基于序列的工艺，结合过滤和基于色谱的方法设计。这种策略的一个很好的例子是切向流过滤，它能够以 125 倍的浓度纯化 MSC 外泌体。
另一个挑战是外泌体亚群的异质性。几乎所有研究都使用外泌体来指代分离的细胞外囊泡。这种歧义部分是由于提取方法无法分离外泌体亚型，以及缺乏对每种类型外泌体的准确描述，因为它们的许多特性在外泌体亚型之间重叠，例如大小和标记。
当观察到用不同大小的树突状细胞分离的外泌体可以诱导不同类别的 T 细胞如细胞毒性 T 细胞、辅助性 T 细胞和调节性 T 细胞时，人们认识到了这一问题的重要性。此外，外泌体产品的生物活性物质的定量测定仍然是其治疗规模发展的主要挑战。
根据 FDA 标准，效力被定义为产品产生预期结果的特定能力或容量。有必要应用一个独特的效力单位来评估外泌体效力，以标准化实践并克服批次间产品之间的不一致和差异。值得注意的一点是，体外效力测定必须能够准确预测体内结果，以便它针对每种疾病、适合指定目的并与最终功能相关。例如，为了定义 MSC 外泌体的效力，它们的免疫调节特性已被用于在与它们孵育过程后从单核细胞中诱导 IL-10。
基于外泌体的临床试验的另一个障碍是分配给它们的促凝血活性。这是外泌体及其起源细胞的生物学特性，因为它们的表面携带相同的受体和蛋白质，包括磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸是众所周知的促进凝血活性的关键成分，组织因子是凝血的主要引发剂。细胞来源、传代数和活力是能够在外泌体给药后加强血液中凝血级联的其他重要因素。
一种防止外泌体促凝活性的建议解决方案是使用抗凝剂（肝素和比伐卢定）的组合进行治疗。研究证明单一疗法只能通过肝素进行，因为在外泌体的促凝血活性中使用不同的蛋白质是无效的。
此外，外泌体分离产生的最终产品的质量是最小化外泌体凝血活性的另一个有效因素。尼尔森等人。表明，增加分离外泌体的纯度并去除更多污染物，包括血浆蛋白和脂蛋白，可降低癌症患者血栓形成的风险。许多患有 COVID-19 的住院患者都面临着更高的凝血病和静脉血栓栓塞风险，目前需要服用抗凝和纤溶药物。因此，建议极其谨慎地进行进一步分析，以预防或减少 COVID-19 患者外泌体的可能并发症，这些患者面临血栓形成的高风险。
相比之下，最近的一项研究。证明 MSCs 可以通过平衡止血因子来降低 COVID-19 中血栓形成和凝血的风险。该功能涉及多种机制，(1) MSCs 通过降低促炎细胞因子如 TNF-α、IFN-γ、IL 的表达，减少血管内皮细胞的凋亡，进而减少血管损伤和弥散性血管内凝血 (DIC) -6。(2) MSCs 对免疫细胞的抑制，包括 T 细胞毒性淋巴细胞、NK 细胞和 B 细胞，可防止微血栓纤维蛋白的形成，并且 (3) MSCs 改变巨噬细胞极化向 M2 表型的分化，从而促进新血管形成和组织修复。
表3总结了 MSC 疗法和 MSC 外泌体疗法治疗 COVID-19 的比较。
表3 MSC-疗法和MSC-外泌体疗法治疗COVID-1的比较总结
这种能力很可能存在于它们分泌的外泌体中，这为 MSC-外泌体治疗 COVID-19 患者增加了另一个好处。
总之，创建新的临床治疗策略不仅需要多年的临床前研究，还需要成功完成三个不同的临床阶段。在过去的十年中，MSC-外泌体的治疗潜力及其在临床前和动物模型中的能力得到了评估，希望能找到治疗不治之症的新方法。COVID-19 危机是评估从 MSC-外泌体治疗潜力中获得的知识的机会。在中国进行的第一项临床研究结果表明，MSC-外泌体可有效避免 COVID-19 的进展并治愈受损的肺部。此外，安全性、稳定性和可扩展性等内在特性使外泌体成为 COVID-19 理想且实用的治疗选择。
原文作者Nashmin Fayazi Hosseini等，2022年1月发表在国际学术期刊Biotechnology Letters 上，原标题Stem cells or their exosomes: which is preferred in COVID-19 treatment?本文为节选编辑。
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