FSHW | 光甘草定抑制皮肤黑色素生成的机制研究

Introduction

黑色素是由黑色素细胞合成并分布于动物皮肤或者毛发的一种呈现黑褐色的物质。正常的黑色素调控有利于抵御外界因素对皮肤的刺激伤害，然而，异常的黑色素调控与积累会使皮肤出现各种斑点问题，严重的可能会导致黑色素瘤。因此，针对皮肤黑色素调控机理寻找治疗皮肤黑色素异常相关疾病的药物具有重要的意义。

 

光甘草定是一种提取自光果甘草的多酚黄酮类化合物，除了显著的美白活性，光甘草定还具有抗炎、抗氧化、神经保护等多种生物活性，在心脑血管及化妆品领域得到广泛应用。目前，在皮肤黑色素方面，相关研究表明光甘草定有显著的抑制黑色素生成及抗氧化作用，这一作用可通过抑制酪氨酸酶的活性并下调黑色素生成相关因子的表达来实现，但潜在的机制仍未完全了解。广东工业大学Chunxing Pan、Zhiyun Du*、Zhengqiang Yuan*等通过分子对接模拟、酪氨酸酶活性测定实验、建立α-黑色素细胞激素（α-Melanocyte-stimulatinghormone，α-MSH）诱导B16黑色素瘤细胞的体外细胞模型及UVA辐射诱导小鼠色素沉着模型，系统性研究了光甘草定对黑色素调控作用及相关机制，为光甘草定在皮肤黑色素调控方面的广泛应用提供了理论与实验依据。

 

Results and Discussion

光甘草定对B16黑色素瘤细胞的体外细胞毒性

光甘草定对B16黑色素瘤细胞的细胞毒性如图1所示，光甘草定在浓度不高于30 μmol/L时对B16细胞没有细胞毒性。因此，选择了5 μmol/L和30 μmol/L的光甘草定浓度用于开展后续的B16细胞实验。

 

图1  光甘草定对小鼠B16黑色素瘤细胞的细胞毒性

 

光甘草定与酪氨酸酶、MITF的分子对接模拟实验

使用分子对接程序AutoDock（4.2.6）来模拟呈现光甘草定与酪氨酸酶、小眼畸形相关转录因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）之间的相互作用。本环节选用了已知的酪氨酸酶活性抑制剂α-熊果苷和托酚酮作为参照对象，结果如图2所示，托酚酮方式通过与Asn260残基形成氢键以及与活性位点中的2个铜离子形成两个非氢键来与酪氨酸酶结合（图2a）。α-熊果苷通过与Asn260和Met280残基形成氢键并与活性位点中的一个铜离子形成非氢键来与酪氨酸酶结合（图2b）。光甘草定通过与Met319和Glu322残基形成氢键结合到酪氨酸酶的活性位点（图2c）。光甘草定也可以通过与MITF的DNA结合位点中的Arg216和Asn219残基形成氢键与MITF结合，表明其可能直接抑制MITF转录活性（图2d）。分子对接模拟实验中，对接能量是估计配体与其受体之间相互作用的参数。光甘草定与酪氨酸酶和MITF的对接能分别为-7.16和-6.67 kcal/mol。相比之下，α-熊果苷和托酚酮与酪氨酸酶对接能量分别为-4.37和-4.89 kcal/mol。这表明光甘草定可以与酪氨酸酶和MITF结合并形成稳定的复合物。光甘草定可能比α-熊果苷和托酚酮具有更高的酪氨酸酶结合亲和力。

 

图2  不同化合物与酪氨酸酶、MITF和化合物之间分子对接模拟结果

 

光甘草定抑制酪氨酸酶活性及黑色素生成的体外研究

体外酪氨酸酶单酚酶活性测定实验、体外的酪氨酸酶二酚酶活性测定实验以及B16细胞内酪氨酸酶活性测定实验结果表明，光甘草定比α-熊果苷表现出更优越的酪氨酸酶活性抑制效果（图3a，b）。已知酪氨酸酶是黑色素生成过程中的重要参与角色之一，通过构建α-MSH诱导B16黑色素瘤细胞产生黑色素的体外细胞模型，可以进一步测定光甘草定对B16细胞中黑色素生物合成的影响。结果如图3c，d所示，光甘草定比α-熊果苷更显著地抑制了B16细胞中的黑色素生成。

 

图3  光甘草定对蘑菇酪氨酸酶活性、细胞内酪氨酸酶活性和黑色素生成的抑制作用

 

光甘草定通过调控黑色素生成相关因子来抑制B16细胞中的黑色素生成

黑色素生成相关因子包括促黑素细胞激素受体（MC1R）、小眼相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）、TYR相关蛋白-1（TRP-1）和TYR相关蛋白-2（TRP-2）。光甘草定干预α-MSH诱导B16黑色素瘤细胞产生黑色素的体外细胞模型后，通过Q-PCR和Western-blot检测α-MSH诱导后的B16细胞中黑色素生成相关因子的转录与表达，结果如图4所示，光甘草定可通过下调黑色素生成相关因子的转录和表达来抑制黑色素生成。

 

图4  光甘草定对B16细胞中黑色素生成相关因子表达的影响

 

光甘草定通过调控PKA、MAPK信号通路来抑制B16细胞中的黑色素生成

α-MSH可以通过α-MSH/cAMP信号通路显著增加黑色素细胞的酪氨酸酶活性，而PKA被cAMP激活，磷酸化的PKA（p-pPKA）紧接着对CREB进行磷酸化修饰（p-CREB），激活MITF后促进黑色素的生成。而在MAPK通路中，磷酸化的ERK（p-ERK）会触发MITF的泛素化和降解，从而使黑色素生成量下降。磷酸化的p38（p-p38）或磷酸化的JNK（p-JNK）激活MITF，上调酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2等黑色素生成相关因子的蛋白合成，最终刺激黑色素细胞生成黑色素。使用光甘草定对α-MSH诱导B16黑色素瘤细胞产生黑色素的体外细胞模型进行干预，结果如图5所示，光甘草定可显著下调α-MSH诱导后的B16细胞中cAMP的表达（图5a），抑制下游的PKA/CREB、P38、JNK信号通路的磷酸化进程，同时促进ERK信号通路的磷酸化进程（图5b，c），从而在一定程度上抑制刺激黑色素生成的信号传递，最终减少黑色素的生成。

 

图5  光甘草定对PKA和MAPK途径中黑色素生成相关因素表达的影响

 

光甘草定可改善UVA辐射诱导的小鼠皮肤色素沉着

UVA辐射会导致皮肤黑色素过度合成、沉淀，因此本环节构建了UVA辐射诱导小鼠色素沉着模型（图6a）来评估光甘草定的体内抗黑色素生成活性，结果表明，光甘草定可显著改善UVA小鼠背部皮肤黑色素沉淀、红肿、干燥脱屑现象（图6b，c）。收集小鼠背部的皮肤，通过Elisa、HE染色检测发现，光甘草定显着降低了UVA辐射后皮肤中cAMP的表达，并有效缓解了因UVA辐射导致的皮肤受损、表皮增厚（图6d，e）。通过Fontana-Masson染色实验可观察到，UVA辐射后皮肤中黑色素显著增加，而光甘草定干预后可有效地减少了表皮中黑色素的沉积（图6f）。以上实验数据表明，光甘草定的给药干预可以减轻UVA引起的皮肤炎症、黑色素的生成和在表皮中的积累。

  

图6  光甘草定对UVA辐射小鼠的皮肤色素合成和cAMP表达的影响

 

Conclusion

综上所述，本研究从分子对接模拟、酪氨酸酶活性测定实验、α-MSH诱导B16黑色素瘤细胞的体外细胞模型及UVA辐射诱导小鼠色素沉着模型的角度，证实了光甘草定具有优越的抑制黑色素合成的作用，并揭示了背后的可能机制，为光甘草定在皮肤黑色素调控方面的更广泛应用提供了理论和实验依据。

The mechanisms of melanogenesis inhibition by glabridin: molecular docking, PKA/MITF and MAPK/MITF pathways

Chunxing Pan^a,1, Xiaoying Liu^b, Yating Zheng^a, Zejun Zhang^a, Yongliang Li^c, Biao Che^b, Guangrong Liu^b, Lanyue Zhang^a, Changzhi Dong^d, Haji Akber Aisa^e, Zhiyun Du^a,*, Zhengqiang Yuan^a,*

^a School of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China

^b Infinitus(China) Company Ltd., Guangzhou 510663, China

^c Foshan Allen Conney Biological Technology Co., Ltd., Foshan 528225, China

^d Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, ITODYS, UMR 7086 CNRS, France

^e The Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Arid Zone, Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chi nese Academy of Sciences, Ürümqi 830011, China

¹ These authors contributed equally to this work.

*Corresponding authors.

Abstract

Glabridin is the main ingredient of hydrophobic fraction in licorice extract and has been shown to have anti-melanogenesis activity in skins. However, the underlying mechanism(s) remain not completely understood. The aim of this study is thus to elucidate the possible mechanisms related to the melanogenesis suppression by glabridin in cultured B16 murine melanoma cells and in UVA radiation induced hyperpigmentation model of BALB/c mice as well. Molecular docking simulations revealed that between catalytic core residues and the compound. The treatment by glabridin significantly downregulated both transcriptional and/or protein expression of melanogenesis-related factors including melanocyte stimulating hormone receptor (MC1R), microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase (TYR), TYR-related protein-1 (TRP-1) and TRP-2 in B16 cells. Both PKA/MITF and MAPK/MITF signaling pathways were found to be involved in the suppression of melanogenesis by glabridin in B16 cells. Also in vivo glabridin therapy significantly reduced hyperpigmentation, epidermal thickening, roughness and inflammation induced by frequent UVA exposure in mice skins, thus beneficial for skin healthcare. These data further look insights into the molecular mechanisms of melanogenesis suppression by glabridin, rationalizing the application of the natural compound for skin healthcare.  

Reference:

PAN C X, LIU X Y, ZHENG Y T, et al. The mechanisms of melanogenesis inhibition by glabridin: molecular docking, PKA/MITF and MAPK/MITF pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(1): 212-222. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.011.