世界首个根据基因组信息快速设计细菌疫苗的新方法

-有望缩短活疫苗开发时间并降低开发成本-

本文3792字，阅读约需9分钟

摘   要：日本农研机构以猪丹毒杆菌为模型，从该细菌的基因组信息中只选出与氨基酸合成有关的基因，并确定了其中使该细菌在感染小鼠免疫细胞（巨噬细胞）时表达增强的基因，然后将这些基因从该细菌的基因组中去除，从而成功制备了一种减毒疫苗候选菌株。这是世界首次成功通过该方法制备疫苗候选菌株。这种方法对表现出“基因组减小”遗传特征的细菌十分有效，并有望能识别出更多细菌的致病基因。

关键词：日本农研机构、猪丹毒杆菌、基因组、氨基酸合成、减毒疫苗

要点

日本农研机构以猪丹毒杆菌^1）为模型，根据基因组信息推断出与致病性相关的基因，并通过去除这些基因人为减弱细菌毒性，世界首次建立了一种能够在短时间内合理设计活疫苗^2）的方法。以往的细菌活疫苗开发往往耗资费时，本研究成果有望简化开发过程。

摘要

在贯彻饲养卫生管理的基础上使用有效的疫苗是预防传染病最为有效的方法。但新疫苗开发成本高，耗时长。特别是用于牲畜和家禽的活疫苗，大部分是在与自然宿主不同的动物或细胞中，或在会引起DNA排列和结构变化的物质存在的条件下，对病原体进行反复培养和传代，使基因组^3）随机发生变异从而降低毒性。因此在大多数情况下，活疫苗的减毒机制是未知的，而且存在安全隐患，如部分活疫苗存在毒力返强风险等问题。

针对细菌开发安全有效的活疫苗，首先要分析病原体基因组中包含的极其丰富的基因，以及这些基因的表达调控机制，从而确定致病基因，然后通过去除这些基因或引入变异，使其达到理论上减毒。然而，识别致病基因需要耗费大量劳动与时间，因此短期内制备优秀的活疫苗是极为困难的。

日本农研机构以猪丹毒杆菌为模型，从该细菌的基因组信息中只选出与氨基酸合成有关的基因，并确定了其中使该细菌在感染小鼠免疫细胞（巨噬细胞^4））时表达增强的基因，然后将这些基因从该细菌的基因组中去除，从而成功制备了一种减毒疫苗候选菌株。这是世界首次成功通过该方法制备疫苗候选菌株。这种方法对表现出“基因组减小⁵⁾”遗传特征的细菌十分有效，并有望能识别出更多细菌的致病基因。

详细信息

开发的社会背景

当下，耐药菌株的出现逐渐成为社会性问题，通过开发疫苗预防传染病也变得越发重要。畜牧业部门使用的疫苗除了安全性和有效性之外，还必须具备更高的经济性。近年来，出于动物福利方面的考量，日本越发重视在饲养家畜的过程中采用不导致动物应激的疫苗接种方法，加之日本的家畜养殖规模越来越大，疫苗的接种是否方便就显得尤为重要，比如通过饮水口服接种等接种方式受到青睐。但开发这样的疫苗费时费力，畜牧业一线亟需一种新的开发方法，以在短时间内经济地开发出易于使用的活疫苗。

研究背景

日本农研机构一直致力于使用猪丹毒杆菌的减毒株开发口服接种的载体疫苗^6）。开发载体疫苗需要制备并使用安全的、具备较高免疫诱导效果的减毒株，但要从猪丹毒杆菌基因组的1700多个基因中确定有关致病性的基因是极为困难的。

猪丹毒杆菌等许多胞内寄生菌^7）都是依靠被感染的细胞来获得生存所需的营养物质，因此，许多参与营养物质合成的基因便成为不必要的基因，在进化过程中从基因组中脱离，即发生“基因组减小”现象。本研究建立了如下假说并开始进行实验（图1A）：假设在猪丹毒杆菌的基因组中，与营养物质合成有关的基因未脱离并留存在基因组当中，且这部分基因是对该细菌的感染非常重要的“致病基因”。

研究内容和研究意义

基因组分析结果表明，猪丹毒杆菌能够合成7种氨基酸，但除此以外的氨基酸则需要依赖被感染的细胞。因此，本研究针对留存于猪丹毒杆菌基因组上的与氨基酸合成相关的共计14个基因进行了分析，确认在将本细菌与小鼠巨噬细胞共同培养时，这些基因是否活跃，即是否进行表达。经确认，在解析的14个基因中，有7个基因进行了活跃表达（图1B）。本研究将这7个基因选为“致病基因”的候选基因，但这7个基因当中只有3个参与脯氨酸合成的基因（proA，proB，proC）可以通过基因操作从基因组中移除，推测其余11个基因为猪丹毒杆菌生存所必需的基因。

针对参与脯氨酸合成的3个基因，研究共制备了5种基因缺陷菌株（图1c），分别为：仅缺少3个基因当中的一个的缺陷菌株（ΔproA，ΔproB或ΔproC，（Δ表示缺少）），同时缺少proA和proB两个基因的缺陷菌株（ΔproBA），以及同时缺少proA、proB和proC三个基因的缺陷菌株（ΔproBAC）。通过小鼠巨噬细胞可以观察到，上述菌株的增殖能力均降低，表明菌株减毒成功（图2a、2b）。同时观察到，对上述基因缺陷菌株免疫的小鼠也表现出对强毒株攻击的完整防御。研究还表明，通过让猪口服与牛奶混合的ΔproBAC，成功诱导了猪对猪丹毒杆菌的完整防御（表1）。

在猪丹毒杆菌中观察到的“基因组减小”现象，在支原体、莱姆病螺旋体、立克次体、衣原体和巴顿氏菌等其他病原体当中也能被观察到。此外，在链球菌和梭状芽孢杆菌中也发现了参与氨基酸合成的基因大量缺失的现象。仅关注基因组当中参与营养物质合成的基因，从而搜索致病基因的方法，或同样适用于上述病原菌的活疫苗开发。

未来计划与前景展望

不同于传统活疫苗，利用本技术开发的活疫苗候选菌株的减毒机制是清晰可知的，其毒力返强的可能性极低，因此本疫苗候选菌株的实用化值得期待。同时，研究小组还在评估使用该疫苗作为载体疫苗的可能性，即通过在上述菌株上表达不同病原体的基因，同时预防猪丹毒以外的其他疾病。

术语说明

1）猪丹毒杆菌

一种人畜共患传染病的病原体，能够感染包括猪在内的哺乳动物及鸟类等多种动物。可引起猪和野猪的败血症、关节炎、心内膜炎等症状。猪和野猪猪丹毒在日本被指定为“应通报传染病”（译注：即需要上报政府并进行监测的传染病），每年可确认到约2000头猪发病。

2）活疫苗

使用能够感染但不致病的减活细菌或病毒的疫苗。

3）基因组

指生物体所有遗传物质（遗传信息）的总和。细菌的基因组包括染色体和质粒。

4）巨噬细胞

一种白血球。一种能够吞噬和杀死病原体的免疫细胞。

5）基因组减小

在进化过程中使不必要的基因从基因组中脱落，使基因组缩小的现象。这是一种退行性进化，已知有许多胞内寄生菌具有这种特征。

6）载体疫苗

一种重组疫苗，在减毒病原体内插入能够编码目标抗原蛋白的基因，从而制备的疫苗。

7）胞内寄生菌

寄生于巨噬细胞等吞噬细胞内并进行繁殖的细菌。

参考图

图1 猪丹毒杆菌的致病基因鉴定流程图

A：关注基因组中参与营养物质合成的基因（本研究中只有氨基酸合成基因）。

B：感染小鼠巨噬细胞6小时后，分析氨基酸合成基因的表达。
观察到↓所示的7个基因的表达增强。
C：删除参与脯氨酸合成有关的三个基因。

图2a 猪丹毒杆菌感染小鼠巨噬细胞后的增殖

可以得知缺失了3个基因（proA、proB、proC）中某一个的猪丹毒杆菌在小鼠巨噬细胞中增殖能力降低且毒力减弱。

图2b 猪丹毒杆菌感染小鼠巨噬细胞16小时后，其细菌增殖图像。荧光染色后在显微镜下拍摄。

在亲株样本中，可以观察到细胞内外有大量染成红色的菌体（照片A）。而在删除了脯氨酸合成基因的菌株中则观察到较亲株更少的菌体（照片B-F）。

红色:猪丹毒杆菌的菌体。蓝色：巨噬细胞的细胞核。绿色：细胞骨架。

表1 口服ΔproBAC菌株的疫苗效果评估实验

翻译：王京徽

审校：李   涵

通稿：李   涵

获取日文原文