【蛋白设计】理性设计快结合蛋白

在2018年诺贝尔化学奖中，Frances H. Arnold的“酶的定向进化”占奖项的一半，可见根据蛋白质的进化规律进行突变设计可以创造出特殊功能的蛋白。在配体受体相互作用领域中，突变会导致亲和力改变从而引起差异的信号反应的功能选择性，本次将介绍一种通过改变配体受体结合速率常数的理性设计方法：

在扩散控制的两种蛋白结合过程中，蛋白通过布朗运动（Brownian motion）扩散靠近，寻找最佳构象直到两蛋白碰撞结合。蛋白A、B结合形成复合物C可以用两步动力学形式表示(Pang et al.)：

k_D和k_-D分别表示形成一个弱结合复合物的结合和解离速率常数，A*B也被称为遭遇络合物（encounter complex），是通过长程的静电作用形成，在最后复合物C形成过程中，主要是氢键、范德华力以及疏水作用发挥重要作用。

在蛋白质-蛋白质相互作用过程中，k_on表示结合速率常数，k_off表征解离速率常数，蛋白间亲和力k_D是这两个速率常数的函数，k_D=k_off/k_on。解离速率常数主要由短程的相互作用决定，包括范德华力、氢键作用、疏水作用和盐桥，结合速率常数主要由扩散决定，并能通过合适的库伦静电作用力来加强(Selzeretal.; Selzer and Schreiber)，静电相互作用在蛋白间结合常被布朗动力学模拟（Brownian dynamic simulations）。

快结合和慢解离都能增强结合亲和力，但慢解离意味着复合物将能保持长效的结合状态，会造成持续的下游信号开或关。在Ras与Raf结合的过程中，蛋白能在1秒内解离，但是由于结合速率常数很大，导致蛋白结合的亲和力仍然保持在nM范围, 而且另一非自然效应物Ral与Raf的区别在于，它们与Ras的结合速率常数不同(Kiel et al.)。在酶底物结合过程中，结合速率常数能达到10⁸M^-1s^-1甚至更高，例如核糖毒性的局限曲菌素与核糖核酸酶A（RNaseA）的结合，当几种蛋白竞争相同受体或者一个蛋白面对多条信号通路时，动力学控制会发挥重要的作用，从这个角度看，也很容易理解不成熟蛋白能迅速和伴侣蛋白GroEL快速结合现象。通过Rho GTPases  Cdc42 和TC10、Ras效应物Raf和Ral表现的结合现象，结合速率的差别也可能是其特异性的一种机制。

两蛋白在溶液中的扩散碰撞也影响结合过程，因此干扰扩散过程也影响蛋白相互作用，例如溶剂粘性、离子强度、PH等(Schreiber)。由于胞质内稠密的环境，耗尽效应（Depletion effect）和拥挤（Crowding）也可能会影响蛋白间结合速率(Schreiber et al.; Zhou)。对于细胞膜上受体，在与配体结合过程中还可能受锚定蛋白的影响(Zhou and Szabo)。由于体内环境。通过突变寻找配体受体不同结合动力学成为有效的手段，将两蛋白结合区域附近带电氨基酸突变，会明显改变蛋白间的结合速率常数，而对解离速率常数影响较小，相关的位点突变对结合动力学影响的现象已经在TEM1-BLIP，barnase-barstar，interferon-receptor，growth hormone-receptor和leukin-4-receptor等研究中被证实(Schreiber)。2000年，Selzer T等人 利用PARE理性设计了快结合蛋白，通过改变Hot spot附近氨基酸的静电作用，最终得到结合速率常数提高250倍的蛋白(Selzer et al.)。 2007年，Shaun Lippow等人通过计算理性设计蛋白突变，增强了抗体结合的动力学常数(Lippow et al.)。2011年，Huan-Xiang Zhou等人理性设计了5000倍结合动力学差异的细胞因子。理性设计得到结合动力学不同的蛋白实例还有很多，经过相关实验的验证，表明理性设计的方法在生成结合动力学不同的蛋白突变体方面是可行的。

理性设计快结合蛋白质不仅能得到高亲和力的蛋白突变体，更为研究者研究配体受体结合动力学提供了有力的工具。近来，有许多文章发现配体受体结合动力学会影响细胞下游的信号反应，例如，2017年，Ah Ram Kim等人发现突变的红细胞生成素（EPO）R150Q会减少EPOR二聚化，进而限制下游信号的激活导致细胞无法正常分化(Kim et al.)。故在不同体系下，理性设计结合动力学变化的蛋白突变可以帮助我们理解其在信号转导过程中的重要作用。

参考文献：

Kiel, C., et al. “Electrostatically Optimized Ras-Binding Ral Guanine Dissociation StimulatorMutants Increase the Rate of Association by Stabilizing the Encounter Complex.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 101, no. 25, 2004, pp. 9223–28, doi:10.1073/pnas.0401160101.

Kim, Ah Ram, et al. “Functional Selectivity in Cytokine Signaling Revealed Through a Pathogenic EPO Mutation.” Cell, vol. 168, no. 6, Elsevier, 2017, p. 1053–1064.e15, doi:10.1016/j.cell.2017.02.026.

Lippow, Shaun M., et al. “Computational Design of Antibody-Affinity Improvement beyond in Vivo Maturation.” Nature Biotechnology, vol. 25, no. 10, 2007, pp. 1171–76, doi:10.1038/nbt1336.

Pang, Xiao dong, et al. “Rationalizing 5000-Fold Differences in Receptor-Binding Rate Constants of Four Cytokines.” Biophysical Journal, vol. 101, no. 5, Biophysical Society, 2011, pp. 1175–83, doi:10.1016/j.bpj.2011.06.056.

Schreiber, G., et al. “Fundamental Aspects of ProteinGèòProtein Association Kinetics.” Chemical Reviews, vol. 0, no. 0, 2000, p., doi:10.1021/cr800373w.

Schreiber, Gideon. Kinetic Studies of Protein – Protein Interactions. Vol. 0, 2002, pp. 41–47.

Selzer, T., et al. “Rational Design of Faster Associating and Tighter Binding Protein Complexes.” Nature Structural Biology, vol. 7, no. 7, 2000, pp. 537–41, doi:10.1038/76744.

Selzer, T., and G. Schreiber. “Predicting the Rate Enhancement of Protein Complex Formation from the Electrostatic Energy of Interaction.” Journal of Molecular Biology, 1999, pp. 409–19.

Zhou, Huan Xiang. “Protein Folding and Binding in Confined Spaces and in Crowded Solutions.” Journal of Molecular Recognition, vol. 17, no. 5, 2004, pp. 368–75, doi:10.1002/jmr.711.

Zhou, Huan Xiang, and Attila Szabo. “Enhancement of Association Rates by Nonspecific Binding to DNA and Cell Membranes.” Physical Review Letters, vol. 93, no. 17, 2004, pp. 1–4, doi:10.1103/PhysRevLett.93.178101

---

作者: Shawn Guo