2019年4月8日，哥伦比亚大学的顾伟教授课题组在Nature Cell Biology上发表了一篇题为“ALOX12 is required for p53-mediated tumour suppression through a distinct ferroptosis pathway”的文章，介绍了一种由脂氧合酶ALOX12蛋白介导，ACSL4非依赖性的铁死亡调控方式—p53-mediated ferroptosis，解释了p53在铁死亡应答中的作用机制，这种铁死亡方式独立于GPX4信号通路，对p53调控的肿瘤抑制至关重要（图1）。该课题组主要关注p53在肿瘤抑制中的活化和稳定机制。
图1 脂氧合酶ALOX12与GPX4蛋白参与调控不同的铁死亡信号通路
——生物学背景——
虽然已经知道p53可以通过细胞周期阻滞、细胞凋亡等方式抑制肿瘤发展，但是越来越多的证据表明，p53也可以通过代谢调节方式增强肿瘤抑制。近年来有研究发现p53可以通过其代谢靶点在铁死亡应答中发挥重要作用，但是，还不知道是哪种蛋白调控了p53诱导的铁死亡，这种由活性p53蛋白调控的铁死亡方式又被称为p53-mediated ferroptosis。
众所周知，GPX4是铁死亡的主要调控蛋白，但是活性p53调控的铁死亡对GPX4蛋白却没有明显的依赖性，p53的表达失活虽然能够部分缓解erastin诱导的铁死亡，但是被erastin 或者 GPX4 抑制剂诱导的铁死亡却不依赖于p53, p53-mediated ferroptosis通过什么机制进行调控尚不清楚。
——正文——
1）脂氧合酶ALOX12对p53-mediated ferroptosis是必需的
细胞内的脂质过氧化物水平可以通过GPX4蛋白催化还原降低，也可以通过脂氧合酶催化的氧化反应增加。哺乳动物的脂氧合酶家族包括六个蛋白亚型(ALOXE3、ALOX5 ALOX12, ALOX12B, ALOX15和ALOX15B)，它们具有不同的底物特异性。为了确定这些脂氧合酶对于p53调控的铁死亡是否必需，作者进行了RNA干扰(RNAi)功能缺失筛选实验，检测每种亚型脂氧合酶是否影响p53调控的铁死亡。结果发现在使用RNA干扰ALOX12表达时，p53-mediated ferroptosis能够被显著特异性降低，而其他五种亚型脂氧合酶则没有这种作用(图2a)。
同样，在使用Nutlin诱导p53活化产生铁死亡时，干扰ALOX12转录对p53及其调控靶点(如SLC7A11、MDM2和p21)的表达没有明显影响 (图2d)，但却会降低p53-mediated ferroptosis水平(图2c)。在ALOX12 knock-out的U2OS细胞中，p53-mediated ferroptosis水平下降，这进一步证明了脂氧合酶ALOX12对于p53调控的铁死亡是必需的。
图2 脂氧合酶ALOX12对于p53-mediated ferroptosis至关重要
2）GPX4抑制剂不影响p53-mediated ferroptosis
有趣的是，在erastin诱导的铁死亡中，GSH/GSSG的比值下降，然而在Nutlin诱导的p53活化引起的铁死亡中，GSH/GSSG的比值却没有明显变化（图3a, b）。在表达GPX4产生的铁死亡中，在加入GPX4抑制剂RSL3时，内源性脂质过氧化水平会升高，而在p53-mediated ferroptosis中，内源性脂质过氧化水平则不会发生明显变化(图3d)。在ALOX12敲除的细胞中，铁死亡水平大大下降，并且铁死亡中的上调Marker Ptgs2表达下降（图3e，g），表明p53-mediated ferroptosis是通过一个独特的信号通路进行调控，该通路独立于GPX4信号通路，并且不受GPX4蛋白调控。
3）ALOX12的失活阻碍了p53调控的肿瘤生长抑制
在肿瘤异体种植模型中，敲除ALOX12会破坏p53调控的肿瘤生长抑制（图3f）。在经典的Eμ-Myc淋巴瘤模型中，ALOX12单个等位基因的突变（Alox12+/−）会大大缩短致死性肿瘤形成时间，从原来的220天缩短到70天（图4d）。此外, 两个已知的铁死亡分子Marker Ptgs2和Chac 在Alox12单基因敲除的（Alox12+/−）Eμ-Myc小鼠中出现了明显的下调，相比之下，两个凋亡调控分子p21和p53则保持不变(图4g)，表明Alox12的突变不是通过p53调控的细胞周期阻滞和细胞凋亡影响肿瘤形成，而是通过p53调控的铁死亡影响肿瘤形成。在杂合型Alox12+/–突变的MEFs细胞中，p53存在时使用p53激活分子TBH诱导会产生明显的铁死亡，但在敲除p53时，则使用TBH诱导不会产生铁死亡(图4b,c)，表明ALOX12参与调控的铁死亡需要p53。
图4 在Eμ-Myc淋巴瘤模型中单个 Alox12 等位基因突变就会加速肿瘤形成
4）人类癌症中产生的ALOX12错义突变影响了ALOX12蛋白活性和p53调控的铁死亡
检查Oncomine数据库发现, 在各种各样的人类癌症中，包括宫颈鳞状细胞癌, 头颈部鳞状细胞癌，食管鳞状细胞癌和急性髓性白血病中， ALOX12的表达均出现了下调。此外，在人类肿瘤标本COSMIC数据库中存在几种ALOX12错义突变，包括R562Q/W、A372T/D和G381R（图5a），并且这些突变位点在脂氧合酶中是进化保守的，这些肿瘤源性的ALOX12错义突变(G381R、R562Q、R562W、A372T和A372D)会显著减弱脂氧合酶活性 (图5c)。此外，在敲除ALOX12的U2OS细胞中表达野生型ALOX12蛋白，可以恢复铁死亡，而表达ALOX12 G381R突变体则不能恢复p53调控的铁死亡(图5d)。在ALOX12敲除的 H1299细胞中也获得了类似的数据(图5e,f)。综上所述，在人类癌症中，ALOX12基因下调、突变，或者肿瘤来源的ALOX12错义突变，均会影响脂氧合酶ALOX12活性和p53调控的铁死亡。
图5 人类癌症来源的ALOX12错义突变阻碍了ALOX12蛋白活性和p53-mediated ferroptosis
5）ALOX抑制剂ML–355能够抑制p53调控的铁死亡
野生型ALOX12蛋白可以在体外氧化花生四烯酸，其脂氧合酶活性可以被特异性的ALOX12抑制剂ML-355抑制。为了探索p53调控的铁死亡如何在人类癌症中被解除，我们检测了许多保留野生型p53人类癌细胞系中的ALOX12蛋白水平（图6a）。在检测不到ALOX12的HT1080细胞系中，对p53诱导的铁死亡不敏感，虽然HT1080对erastin诱导的铁死亡及其敏感 (图6b,c)。然而，通过在这些细胞系中异位表达ALOX12，这些细胞则会容易产生p53诱导的铁死亡(图6d)。在人类结直肠癌细胞株HCT116也得到了类似的结果(图6e，左侧)。此外, 在同时表达p53和ALOX12的其他细胞系中，p53诱导的铁死亡同样容易被检测到,包括人类肺癌细胞系A549、H460和人类黑色素瘤细胞系A375。并且正如所料, 这些细胞系中产生的p53诱导的铁死亡能够被被ALOX抑制剂ML–355解除(图7 d, f)。
图6 p53-mediated ferroptosis调控机制
图7 在人类癌细胞系中，脂氧合酶ALOX12调控p53-mediated ferroptosis
——小结——
综上，作者发现了一种p53调控的铁死亡方式，这是一种不同于GPX4调控的铁死亡形式，它不需要GPX4蛋白调控，而是通过p53对SLC7A11的转录抑制间接激活脂氧合酶ALOX12引发铁死亡，这种由脂氧合酶ALOX12调控，ACSL4非依赖型的p53-mediated ferroptosis与erastin诱导的铁死亡不同，它不会降低还原型谷胱甘肽GSH与氧化型GSSG的比值，但是这种铁死亡方式对p53调控的肿瘤抑制非常重要。
参考文献：
Bo Chu, Ning Kon et al. “ALOX12 is required for p53-mediated tumour suppression through a distinct ferroptosis pathway.” Nature Cell Biology, 2019 Apr 8. doi: 10.1038/s41556-019-0305-6.
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