【别构】实时观察PDZ结构域中配体诱导的别构转变

2020年10月，来自弗莱堡大学物理研究所的Gerhard Stock课题组和苏黎世大学化学系的Peter Hamm课题组合作在PNAS上发表了题为“Real-time observation of ligand-induced allosteric transitions in a PDZ domain”的文章，介绍了一种实时观察配体诱导的别构转变的方法，使用PDZ2作为模型体系进行研究。

——背景——

别构表示蛋白质或者蛋白质复合物中两个位点的耦合，当配体与远端位点结合后能够改变活性位点的亲和力。由于生物学功能与蛋白质结构密切相关，配体诱导的蛋白质功能变化通常与蛋白质平均结构的变化相关。另一方面，配体的结合也可能会改变蛋白的柔韧性，从而改变结构的变化并为自由能提供熵的贡献，称为“动力学别构”，已经被用于解释配体结合后没有明显构象变化的情况。研究动力学别构的方法主要是NMR光谱学，但是这仅能解释平衡动力学。

尽管结构上的变化和动力学上的变化这两个模型似乎都是合理的，但是“别构信号”的性质还不清楚，所以需要去研究别构的成因。这主要包括三个步骤：1）配体的结合，2）导致蛋白质的原子经历非平衡的时间演化，3）最终导致蛋白质远端位点的结合亲和力发生变化。这被称为“变构转变”，是一个非平衡过程，仅在极少数情况下能直接观察到，一方面是因为结构变化的微小性使得转变途径难以通过实验观察，另一方面是因为分子动力学（MD）模拟的时间尺度的限制。本文主要是发展了一个研究前两个步骤的方法，以PDZ2结构域作为模型体系来研究配体诱导的别构转变。

 

——结果——

由于PDZ结构域结合配体以后的构象变化很小，所以是研究动力学别构的一个很好的例子。PDZ结构域介导的相互作用在许多信号转导复合物中起着关键作用。PDZ结构域中的别构信息流被认为是通过蛋白质中保守的别构网络进行传导的。此处考虑的体系是来自hPTP1E(human tyrosine phosphatase 1E)的PDZ2结构域和连接有偶氮苯部分作为光控开关的RA-GEF-2肽衍生物(Ras/Rap1 associating guanidine nucleotide exchange factor 2)(图1)。通过对偶氮苯部分进行光异构化，可以在精确定义的时间点改变配体的结合亲和力。作者将时间分辨振动光谱法与同位素标记策略结合使用，以实时监测蛋白质的结构变化，并执行大量的（大于0.5 ms的总模拟时间）全原子非平衡MD模拟与Markov建模相结合来解释根据系统的结构演变得出的实验结果。他们发现该蛋白质的平均结构变化相当小。但是，在实验和MD模拟中，蛋白质的自由能表面都可以以少量的亚稳态构象状态为特征。与将别构作为亚稳态状态的相对群体之间的相互转换的观点相一致，他们看到配体诱导的PDZ2结构域的响应如何最好地描述为自由能态的重塑，以及该响应如何从配体传导到蛋白而不会引起蛋白质结构上的明显变化。

图1. 配体转换的PDZ2结构域。在光控开关（红色）的反式构象中，配体（蓝色）在结合口袋中结合的很好，而当转换为顺式时配体开始移出。

作者利用酰胺I条带范围内的瞬态红外光谱研究配体诱导的构象转变。该带主要来自肽/蛋白质主链的C=O拉伸振动，并且具有强烈的结构依赖性。尽管无法从酰胺I条带确定蛋白质的结构，但是蛋白质结构的任何变化都会在该条带中引起微小但明显的变化（图2A–C）。图2显示了在trans-to-cis（图2D–F）或cis-to-trans（图2G–I）进行光转换后，酰胺I振动光谱区域中的瞬态IR响应。选择性同位素标记可用于区分肽配体与蛋白质的贡献。两种同位素的瞬时IR响应看起来都非常相似，因为该信号主要由可光转换的肽控制，该可光转换的肽直接受到偶氮苯部分的干扰。图2的右图显示了移除可光转换肽配体贡献的double-difference光谱。总体而言，这些double-difference光谱的动力学非常复杂，并且涵盖了多个时间尺度。此外，trans-to-cis（图2F和3A和C）与cis-to-trans转换（图2I和3B和D）的响应不是彼此的镜像，这可能暗示蛋白质在相反方向上采取相同的途径。

图2. PDZ2在酰胺I条带区域的瞬态红外光谱。D–I中的红色表示正吸光度变化，蓝色表示负吸光度变化。

图3A–D中的红线是使用最大熵方法对信号进行时间尺度分析得到的拟合曲线。时间尺度谱在图3A–D中显示为蓝线。上面讨论的每个动力学过程在这些时间尺度谱中都显示为一个峰，并且图3A–D中所示的所有例子的峰图都不同。尽管如此，动力学特征似乎表明相对较少的离散时间尺度(图3E–F)。

图3. 进行trans-to-cis（左）和cis-to-trans（右）转换时，在1,636 cm-1（A和B）和1,579 cm-1（C和D）处的瞬态13C15N-WT差异数据，突出的特征标记为图2中的∗1至∗ 3。E和F显示了相应的动力学特征。G和H显示了分子动力学模拟的动力学特征，它是通过对平均Cα距离的非平衡时间演化的时间尺度分析获得的。

图4A显示了从5×5 µs长的反式平衡模拟中获得的自由能表面，该模拟描述了PDZ2的配体结合态。自由能态揭示了四个定义明确的局部最小值，表明系统的亚稳态构象状态。基于密度的聚类确定状态1接近晶体结构，而状态2则表示结合口袋的开放状态。图4A和B揭示了cis中可及的构象空间大大增加，并且状态5的出现显示了结合口袋的进一步打开。图4D显示了配体的光控开关引起了状态群体的显著转移，主要是从状态1转移到状态2和5。为了说明与这些状态相关的构象变化，图4E显示了状态1和2以及cis中特有的状态5的能量最小结构的叠加图。图4F显示了主要状态对应的蛋白质结构以及配体的位置密度。

图4. 确定亚稳态的构象状态。从PDZ2的trans（A），cis（B）和无配体（C）平衡模拟中获得的自由能态图，是两个基本残基间距离的函数。

——小结——

总的来说，本文结合瞬态红外光谱和非平衡的分子动力学模拟，描述了PDZ2结构域中的配体诱导的构象转变，这种构象转变被认为是造成蛋白质别构通讯的原因。此外，本文的结果暗示纯动力学驱动的别构和构象变化驱动的别构不像之前认为的分的很开，两者之间可能存在相互作用从而允许蛋白根据传入的信号调整它们的自由能态。本文介绍的光控开关方法用途非常广泛，可以让我们了解别构通讯中的“时间”和“速度”。 

参考文献：

Bozovic, O., et al. "Real-Time Observation of Ligand-Induced Allosteric Transitions in a Pdz Domain." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 117.42 (2020): 26031-39.

DOI: 10.1073/pnas.2012999117