前面给大家介绍了第一代ALK 靶向药克唑替尼的研发过程（点此链接查看原文），提到了大部分患者使用克唑替尼在1年左右会发生ALK耐药性突变，部分患者甚至会发生癌细胞脑转移。而克唑替尼很难穿过血脑屏障，其在脑脊液和游离血浆中的浓度比值仅为0.03。因此研发对ALK突变有效且能穿过血脑屏障的二代ALK靶向药是非常重要的。幸运的是，目前已有多款二代ALK靶向药被FDA批准上市了，如诺华的赛瑞替尼 (ceritinib)，罗氏的阿来替尼 (alectinib)和武田制药的布加替尼(brigatinib)等。根据美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）发布的2021v1版的非小细胞肺癌（NSCLC）的临床实践指南，阿来替尼是ALK阳性非小细胞肺癌(NSCLC)中优先级最高的一线治疗药物（图1）。今天，就由笔者给读者们回顾抗癌药阿来替尼的研发过程，深入了解为何阿来替尼是目前ALK阳性NSCLC患者首选的靶向药。
图1. NCCN发布的ALK阳性NSCLC患者的一线治疗指南。
——先导化合物的发现——
日本的中外制药株式会社（Chugai Pharmaceutical Co.，已被罗氏收购)的研究人员从公司内部的分子库筛出了对ALK有弱抑制活性（IC50 = 1.3 μM）的四环化合物7 (图2)，该骨架是以往没有被发现过的；而且不同于克唑替尼对c-MET和ALK的活性都很好，7对c-MET的抑制活性很差（IC50 > 50 μM），说明7有可能是潜在的高选择性ALK抑制剂。接下来就是常规的构效关系研究。研究者首先分析了3号位取代基对ALK抑制活性的影响，结果发现3-取代基的烷基链长度和电子性质对于ALK抑制活性都是不重要的。接下来，研究人员将骨架从苯并呋喃改为吲哚（可以作为氢键给体），发现 3-溴-四环吲哚取代的化合物14的活性（IC50 = 0.10 μM）比相应的11（IC50 = 0.77 μM）提高了7倍。将Br换成氰基后，作者惊讶地发现17的活性提高了10倍（IC50 = 0.008 μM），而且17对ALK阳性细胞的抑制活性也很不错（IC50 = 0.06 μM）。说明氰基很有可能是与ALK上的残基形成了氢键。
然而，小鼠和人肝微粒体的高体外清除率（CL）值表明化合物17易被代谢清除，猜测是与侧链的乙氨基易被代谢氧化相关，因此作者探索不同侧链对分子活性及代谢清除率的影响。如表1所示，含有酰胺或脲侧链（分别为化合物19和20）的衍生物的CL值都较低，但其细胞活性也很弱；类似地，作者发现N连接的侧链衍生物21-23的细胞活性也比化合物17弱。这些结果表明N+离子可能对化合物的细胞活性很关键，作者猜测可能是因为侧链中的N+离子会与ALK蛋白的溶剂可及区域有较好的相互作用。为了阐明N+离子的作用，作者合成了三种哌嗪衍生物（化合物24–26）。如预期的那样，非阳离子的磺酰胺24的细胞活性较弱，而化合物25和26则表现出比17更好的细胞活性。由于N-氧杂环丁烷基衍生物26的CL值比25低，且该基团因其良好的理化性质而被广泛应用于药物开发中，因此作者最后选择了兼具细胞活性和代谢稳定性的化合物26和27进行后续开发。
表1. 不同侧链衍生物的体外活性和代谢稳定性。
——从先导化合物到临床前候选分子——
研究人员根据27与ALK的同源模建结构的对接结果，发现ALK具有很特别的E0区域（A1200和G1201，该区域常作为配体结合的入口），在490个激酶中只有14个具有与之相同的E0区域的氨基酸序列。化合物27的9号位最接近ALK蛋白E0区的A1200残基。因为ALK中E0区的氨基酸残基是疏水性的（A1200和G1201），为了增强与这些疏水残基的相互作用，研究人员筛选了几个9号位的疏水取代基（见表2）。因为8/9号位的C-C偶联反应不易进行，为了方便在9号位上进行取代，研究人员将化合物27的8号位连接的C原子改为N原子，所以化合物27也就对应的改为了化合物13a（见图3）。
图3. 27和13a的分子结构。
9号位取代的甲基没有影响化合物对任何蛋白质的抑制活性（表2）。但是，当取代基比甲基位阻大时，化合物对脱靶蛋白的抑制活性明显变弱（13c-13g），说明空间位阻是抑制脱靶蛋白活性的关键因素。在13c-13g中，对ALK的抑制活性与9号位取代基的体积成反比。C2-单元（乙基和乙炔基）为最适合占据E0区域空间的取代基，与该区域的疏水残基发生疏水相互作用。在代谢稳定性方面，除了位阻最大的13g，其余9号位取代基的影响较小。在所有化合物中，13d显示出很高的靶点选择性和良好的酶和细胞活性，而且代谢稳定性高。
表2. 不同侧链衍生物的体外活性和代谢稳定性。
作者进一步对化合物13d进行优化，最终得到化合物CH5424802（见图4，即阿来替尼），CH5424802拥有比13d更好的激酶选择性，且对ALK的突变同样有效。研究人员在ALK阳性的小鼠模型上测试了CH5424802的功效，20 mg / kg的 CH5424802治疗28天就能观察到小鼠肿瘤快速消退且小鼠无明显体重减轻，停止给药后的4周内肿瘤也没有复发。在药代动力学研究中，测定了CH5424802在小鼠中的半衰期为8.6小时，口服生物利用度为70.8%。这些结果都表明CH5424802是潜在的临床前候选的ALK抑制剂。
图4. 13d和CH5424802的分子结构。
为了探究CH5424802的作用机理，研究人员费尽苦心得到了CH5424802与ALK的共晶结构。如图5所示，不同于克唑替尼与ALK的hinge区形成两个氢键，CH5424802的11号位上的C=O只与hinge区Met1199的N-H形成一个关键的氢键。此外，CH5424802的5号位N-H和3号位氰基，通过乙二醇或水分子与相邻的Lys1150，Glu1167，Gly1269，Glu1270和Arg1253形成氢键网络（图5 C）。CH5424802/ALK的另一个关键相互作用是疏水相互作用，例如N-lobe中的Leu1196与CH5424802的氰基的距离仅为3.57A˚，表明其存在较强的CH/π相互作用。而克唑替尼（PF-02341066）和Leu1196没有观察到类似的相互作用（图5 D）。此外，研究人员通过计算机模拟发现，当ALK发生L1196M突变时，依然可以维持氰基周围的氢键网络，且氰基还能与Met1196的Cγ原子发生CH/π相互作用。CH5424802/ALK与克唑替尼/ALK截然不同的结合机理解释了为何CH5424802会对克唑替尼耐药的突变型ALK有效。
图5. A，CH5424802的分子结构；B，CH5424802与ALK蛋白的共晶结构；C，CH5424802与ALK蛋白的相互作用模式；D，CH5424802/ALK与克唑替尼/ALK的叠加图。
——临床实验——
临床试验表明，ALK的L1196M，C1156Y和F1174L突变会让患者对克唑替尼产生耐药性。研究人员通过一系列的体外酶活实验证明CH5424802对上述三种突变型ALK的活性与野生型ALK类似。接下来就是CH5424802的临床实验结果。图6所示是代号为ALEX的临床试验结果，从图中可看出阿来替尼的临床试验效果是惊人的，其无进展生存期（Progression-free survival , PFS）达到了破纪录的34.8个月，远远好于单独用克唑替尼的10.9个月（图6 A）。由于阿来替尼能透过血脑屏障，对发生癌细胞脑转移的患者是非常有益的，使用阿来替尼的患者的PFS率显著高于对照组克唑替尼（图6 B）。由于其惊人的疗效，阿来替尼也由原来用于克唑替尼耐药后的二线治疗提升到最优推荐的一线治疗。
图6. （A）ALK阳性NSCLC患者的无进展生存期（PFS），（B）出现癌细胞向中枢神经系统（CNS）转移的患者的PFS率。
——讨论与总结——
相比于克唑替尼较为曲折的发现过程，阿来替尼的整个分子发现和改造过程可以说得上是相当迅速和顺利的。此外，从发表的文章来看，研究人员刚开始似乎并没有刻意寻找能穿过血脑屏障的分子，而阿来替尼在临床上却表现出对脑转移患者较好的效果，可以说是无心插柳柳成荫了。总的来说，研究人员首先通过高通量筛选到了化合物7，在无ALK与底物结合结构前提下，根据经验和实验，设计了全新的3-氰基吲哚骨架和N-氧杂环丁烷片段的27号分子。经过一系列的构效关系研究后，最终得到了高抑制活性和高选择性的临床前候选分子CH5424802。
由于CH5424802/ALK独特的结合模式，使得其对克唑替尼耐药的患者（如发生ALK的L1196M，C1156Y或F1174L突变）可能很有效。后续的临床实验也证实了阿来替尼的有效性，凭借惊人的疗效，其先后于2014，2015年分别在日本和美国上市，2018年也顺利在国内上市（商品名安圣莎）。目前，阿来替尼是NCCN和中国临床肿瘤学会推荐的ALK阳性NSCLC患者的一线优先选择方案。据悉，阿来替尼每月用量的原价格大概是5万元，目前其价格仍在医保谈判中，希望今年能有好消息。
参考文献：
1. Kinoshita, K. et al. "Discovery of novel tetracyclic compounds as anaplastic lymphoma kinase inhibitors". Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21 (12), 3788−93.
2. Kinoshita, K. et al. "9-substituted 6,6-dimethyl-11-oxo-6,11-dihydro-5H-benzo-[b]carbazoles as highly selective and potent anaplastic lymphoma kinase inhibitors". J. Med. Chem. 2011,54(18), 6286−6294.
3. Sakamoto, H. et al. "9-substituted 6,6-dimethyl-11-oxo-6,11-dihydro-5H-benzo-[b]carbazoles as highly selective and potent anaplastic lymphoma kinase inhibitors". Cancer Cell 2011, 19(5),679−690.
4. Mok T., et al. "Updated overall survival and final progression-free survival data for patients with treatment-naive advanced ALK-positive non-small-cell lung cancer in the ALEX study". Ann Oncol. 2020, 31(8):1056-1064.
联系客服
