无序蛋白作为一类重要的“难以可药”的靶标，其构象异质性使得基于结构的药物设计策略极具挑战。近年来针对无序蛋白的药物设计逐渐受到人们的重视。p53作为著名的抑癌基因，在约50%的癌症中出现突变。在剩余50%的癌症中，野生型p53的活性主要被MDM2、MDMX等蛋白被抑制。激活野生型p53是一种极具潜力的癌症治疗策略。目前针对MDM2, MDMX等靶标开发的多个化合物正在开展临床实验。多项临床实验结果表明，靶向MDM2的化合物有肠道出血等副作用。因此发展靶向p53的化合物以激活p53通路十分重要。p53包含N端的转录激活区（TAD），中间的DNA结合区和四聚区，以及C端的调控区。p53 TAD1与MDM2、MDMX结合时为形成螺旋结构，但在自由状态下高度无序，这为针对p53 TAD1进行药物设计带来了挑战。本课题组近期于Chemical Science杂志发表题为“Computational strategy for intrinsically disordered protein ligand design leads to the discovery of p53 transactivation domain binding 1 compounds that activate the p53 pathway”的文章，发展了针对无序蛋白药物虚拟筛选的层级计算策略，并获得多个结合p53 TAD1的小分子激活剂。
——虚拟筛选策略——
由于无序蛋白的高度异质性，目前尚无针对无序蛋白药物设计的通用筛选策略。文中提出的针对无序蛋白药物设计的虚拟筛选策略(IDPDVS)，包含四个步骤。第一步为充分的构象空间采样。作者利用当时最新的AMBER14SB力场，使用了两种采样方式，第一种为常规的全原子分子动力学模拟，模拟起始结构p53 TAD1与p300结合的构象，时长为900 ns；另一种为副本交换分子动力学模拟，起始结构为无规卷曲，时长为8.5 µs。第二步为梯度聚类。文中对所得构象分两步聚类，首先是基于功能位点（19-26号残基）的局部骨架RMSD值聚类，然后对所得每一类再进行基于全长骨架RMSD值聚类。第三步为挑选可药性构象。文中利用本课题组开发的Cavity程序，对聚类得到的所有代表性构象进行可药性分析。综合构象丰度和Cavity打分判断口袋的可药性，最终作者挑选了8个潜在可药性口袋。第四步是基于分子对接的虚拟筛选。为了平衡计算成本和对接的精确度，作者首先利用GLIDE-HTVS，分别对8个口袋与所有分子对接打分，从中挑出前50%的分子，再用GLIDE SP模式重新对接打分，挑出排名前1%的分子。然后对这些化合物利用'多构象亲和’策略，结合打分排名和化合物二维结构聚类，从SPECS库中挑选了244个潜在分子进行实验验证。
图1. 无序蛋白药物虚拟筛选策略（IDPDVS）。
——实验验证——
利用表面等离激元共振（SPR），作者对244个小分子进行了结合能力测试，其中10个具有剂量依赖性。作者对这10个分子进一步用MTT实验检测其对癌细胞的抑制率，所有的分子均显示一定的活性。其中1047号分子最具有潜力（图2A），其IC50为37 µM左右，SPR表明其与p53 TAD1结合的Kd值13.8 µM左右（图2B）。为了验证1047是否可以抑制p53-MDM2的结合，作者开展了SPR竞争实验。结果表明1047可以抑制MDM2与p53的结合，并具有浓度依赖性（图2C）。作者进一步验证了该化合物具有一定的细胞选择性。
为了进一步优化，作者对其进行了基于配体的二维相似性搜索，选择70个化合物进行实验验证。其中5个在野生p53细胞系上具有小于50 µM的抑制效果，其中1050显示了细胞选择性（图2D）。SPR表明其与p53 TAD1结合的Kd值为8.9 µM（图2E），竞争实验验证其可以抑制p53和MDM2的结合（图2F）。另外，1047和1050均不与MDM2结合。
图2. 体外结合实验证明1047和1050结合p53 TAD。
nanoBRET实验表明，1047和1050均可以在细胞中抑制p53和MDM2结合（图3A）。通过评估p53及其转录水平（图3B-D），可以看到p53在细胞中积累，但是其转录没有受到分子影响。这证明了活性化合物通过抑制p53的降解来提高p53蛋白水平。p53含量的提高促进p53下游靶基因p21，puma和MDM2的转录和表达。p21的累积会导致细胞周期的停止，而1047和1050均可以使细胞周期阻滞在G1和G2/M期（图3E-F）。
图3. 细胞实验证明小分子抑制p53-MDM2结合并激活p53信号通路。
——结合模式分析——
作者利用NMR验证p53和配体之间的相互作用模式以及结合位点。二维1H-1H全相关谱(TOCSY）谱图表明，在活性化合物结合前后有很明显的化学位移扰动（CSP），主要体现在芳香性残基W23芳香环的氢原子 (图4A)。如果打乱TAD1的序列（shuffled p53TAD1 peptide），则CSP均会降低（图4B），这证明配体和蛋白之间的特异性结合。相较于NMR的结果，MD表明1047会诱导蛋白构象更加坍缩，使蛋白的螺旋含量增加。通过分析1047和TAD1每个残基的接触概率（图4C），可以看到1047倾向于结合TAD1的功能域，并且与W23结合的几率最高，这与NMR结果一致。TAD1自身的接触概率变化表明1047改变了p53 TAD1的构象系综（图4D）。
图4 配体特异性结合p53。A. black为p53，red为结合1047后，green为结合1050后。C. 1047和p53的接触概率。D. 1047结合前后p53 TAD的接触概率变化。
——小结——
本文提出了针对无序蛋白的筛选策略IDPDVS，成功发现了两个靶向p53 TAD1的小分子，这两个分子可以抑制p53-MDM2结合，并激活p53信号通路。根据IDPDVS，针对无序蛋白的药物设计需要充分的构象空间采样，预测潜在的可药性口袋，利用系综对接进行化合物筛选，并且与实验进行紧密结合。此外，文中提出了几条通用规则：疏水程度较高并且含有芳香性残基的区域，更有可能成为可药性位点；基于系综的多构象亲和策略，可以充分考虑无序蛋白的构象异质性，减少结合过程中的熵损失，提高虚拟筛选成功率。这些策略有望加快针对无序蛋白的理性药物设计进程。
参考文献：
Ruan, Hao, et al. “Computational strategy or intrinsically disordered protein ligand design leads to the discovery of p53 transactivation domain 1 binding compounds that activate the p53 pathway.” Chem. Sci. 2021.
DOI: 10.1039/D0SC04670A
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