12%的急性髓系白血病(AML)中存在异柠檬酸脱氢酶的复发性突变,并催化产生代谢产物R-2-hydroxyglutarate(R-2HG),后者具有一定的抗肿瘤活性,然而其对急性髓系白血病代谢过程的具体调控机制尚不明确。2021年1月,陈建军教授及其合作者在Molecular Cell上发表了题为“R-2-hydroxyglutarate attenuates aerobic glycolysis in leukemia by targeting the FTO/m6A/PFKP/LDHB axis”的研究论文,报道了IDH突变所产生的代谢产物R-2HG在敏感型白血病细胞中显著抑制其有氧糖酵解,而对正常的造血干/祖细胞无显著影响。具体机制为,R-2HG通过靶向FTO/m6A/YTHDF2信号通路来下调PFKP和LDHB的表达,发挥糖酵解抑制作用,从而实现其抗肿瘤功能。本研究首次揭示了R-2HG和RNA修饰对白血病有氧糖酵解的调控机制,有望为AML的靶向疗法提供理论基础。
——生物学背景——
肿瘤细胞无论在有氧还是无氧条件下,都倾向于通过相对低效的糖酵解途径来满足能量需求,该现象称为“有氧糖酵解”或“瓦尔堡效应”。利用癌细胞与正常细胞间的代谢表型差异实现对其选择性杀伤,有望作为一个安全,有效的癌症治疗策略。异柠檬酸脱氢酶(IDHs)作为三羧酸循环的关键酶,可逆地催化异柠檬酸转化为α-酮戊二酸(α-KG)。包括急性髓系白血病(AML)在内的多种癌症中均发现IDH1/2的保守精氨酸残基发生突变,突变后的IDH1/2失去了野生型的功能,并获得了将α-KG转化为R-2HG的能力。近年来,诸多临床数据显示,相比IDH野生型患者,IDH突变型AML患者的总生存期更长。然而,对于R-2HG调控白血病细胞代谢的具体机制尚未阐明,基于此,作者便开展了如下研究。
——实验结果——
研究伊始,作者评估了R-2HG对白血病细胞代谢的影响,对R-2HG处理后的NOMO-1细胞(R-2HG敏感型)和NB4(R-2HG耐药型)细胞进行代谢组学分析(图1A)以及通路富集分析后,发现糖酵解/糖异生通路明显富集(图1B)。为进一步研究R-2HG对糖酵解过程的影响,作者采用生化手段对敏感型和耐药型白血病细胞的糖酵解速率进行检测。结果发现,R-2HG的处理显著降低了R-2HG敏感型细胞系(NOMO-1和U937)的糖酵解速率,以及乳酸和ATP的水平(图1C-E),而在对照组中(R-2HG耐药型细胞系)未观察到类似现象。采用IDH1R132H白血病细胞模型来内源产生R-2HG同样发现,其显著降低了敏感型细胞的糖酵解速率,以及乳酸和ATP水平。因此,在R-2HG敏感型白血病细胞中,糖酵解是外源或内源性R-2HG调控的主要代谢途径。
图1.R-2HG在敏感型和耐药性白血病细胞中差异调控细胞代谢。A.NOMO-1和NB4细胞对于R-2HG差异调控的代谢通路鉴定和验证策略流程图。B.代谢通路富集结果。C-E.R-2HG对糖酵解速率(C),乳酸水平(D),ATP水平(E)的影响。此前已有文献报道,FTO是敏感型白血病细胞中R-2HG的关键靶点。为探究FTO是否参与调控R-2HG的代谢效应,作者对敏感和耐药型白血病细胞进行FTO knockdown。在敏感型白血病细胞中,FTO knockdown抑制了细胞增殖/生长(图2A),促进细胞凋亡和细胞周期阻滞(处于G0/G1期),显著降低糖酵解速率和乳酸水平(图2B,C),与R-2HG处理敏感型细胞所观察到的表型相一致。并且,FTO过表达可以逆转上述表型。暗示FTO对于敏感型白血病细胞糖酵解通量调控的重要性。
图2.FTO介导R-2HG对敏感型白血病细胞的糖酵解抑制作用。A.MTT(左图)和细胞计数(右图)结果。B-D.FTO knockdown对NOMO-1细胞糖酵解速率(B)、乳酸水平(C)和氧化磷酸化(D)的影响。
为确定R-2HG/FTO代谢通路下游的靶基因,作者采用m6A-seq和qPCR技术对糖酵解和糖异生相关基因进行如图3A所示的筛选策略,发现敏感型细胞内的PFKP和LDHB可被外源和内源性R-2HG最为显著地下调。Western blot的结果证实,在外源和内源性R-2HG处理的敏感型细胞中,PFKP,LDHB以及FTO均下调(图3B)。并且作者还发现R-2HG对FTO催化活性的抑制是通过下调糖酵解关键酶(即PFKP和LDHB)的表达,从而在敏感型白血病细胞中调控其糖酵解代谢;随后发生的FTO表达的下调可进一步增强R-2HG的代谢调控作用(图3C)。针对PFKP和LDHB的功能缺失实验也进一步证实了PFKP和LDHB是敏感型白血病细胞中R-2HG/FTO通路下游的关键代谢靶点。
图3.R-2HG/FTO通路影响PFKP和LDHB的表达来调控糖酵解过程。A.鉴别R-2HG/FTO通路下游代谢靶基因筛选策略的流程图。B.敏感型细胞中,R-2HG处理后的western blot结果。C.R-2HG对U937细胞中m6A修饰和靶基因表达的影响。
为深入阐明R-2HG/FTO代谢通路调控PFKP和LDHB的具体机制,作者通过miCLIP实验发现,在PFKP和LDHB转录本中均检测到多个m6A峰。此外,m6ART-qPCR实验结果显示,在R-2HG处理或FTO knockdown后,敏感型细胞PFKP和LDHB mRNA中的m6A含量均增加(图4A-D),表明R-2HG/FTO通路可以调控PFKP和LDHB转录本中的m6A水平。此外,CLIP-RT-qPCRassay实验也证明FTO蛋白与PFKP/LDHB转录本具有很强的结合(图4E)。因此,R-2HG/FTO代谢通路以m6A依赖的方式调控PFKP和LDHB的表达。
图4.R-2HG/FTO代谢通路以m6A依赖的方式下调PFKP和LDHB的表达。A-B. NOMO-1(A)和U937(B)细胞在R-2HG作用后,PFKP和LDHB转录本m6A相对丰度。C-D. NOMO-1(C)和U937(D)细胞在FTO KD后,PFKP和LDHB转录本m6A丰度的变化。E.CLIP-RT-qPCR实验结果。
在文章的最后,作者评估了PFKP和LDHB在白血病发生发展过程中的作用。在异种移植白血病模型中进行功能缺失研究发现,FTO/PFKP/LDHB knockdown均能显著抑制小鼠白血病(敏感型AML细胞来源)的发生发展,并显著降低外周血中白血病母细胞的比例,抑制白血病细胞对肝脏和脾脏的浸润,显著延长小鼠的总体存活时间。总的来说,PFKP和LDHB与FTO类似,在体内实验中促进白血病的发生发展,可作为白血病的临床相关治疗靶点。
——小结——
本研究系统阐释了FTO/m6A/PFKP/LDHB信号通路在抑制敏感型白血病细胞糖酵解过程中的作用,也为m6A表观遗传修饰调控癌细胞代谢重编程提供了新思路。此外。R-2HG的抗肿瘤活性以及FTO在白血病中的促癌机制为白血病疗法提供新的药物设计靶点及治疗策略,并促进相应抑制剂在临床癌症治疗中的应用。
参考文献:
Ying Qing,et al. “R-2-hydroxyglutarate attenuates aerobic glycolysis in leukemia by targeting the FTO/m6A/PFKP/LDHB axis.”Molecular Cell (2021).
DOI: 10.1016/j.molcel.2020.12.026
作者: 郭超
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