在应激反应中，人类细胞下调管家基因的转录和翻译。为了下调转录，负延伸因子(NELF)被招募到基因启动子，破坏RNA聚合酶II的延伸。2020年2月5日，Prashant Rawat等在Molecular Cell发表了题为“Stress-induced nuclear condensation of NELF drives transcriptional downregulation”的文章，在这篇文章中，作者发现压力诱导转录调节因子NELF的核凝聚。NELF的天然无序区（IDR）和应激诱导的NELF去磷酸化和SUMO化调控NELF核凝聚。NELF核凝聚有助于增强压力下NELF向启动子的招募，从而驱动转录下调，帮助细胞在应激条件下生存。
——生物学背景——
环境压力触发人体细胞的协调反应，使其适应变化的环境。在热休克和砷暴露等压力下，编码代谢、细胞周期和管家蛋白的mRNAs翻译会迅速停止。已知通过液-液相分离(LLPS)形成的胞质应激颗粒可以储存失活的核糖体和mRNA，促进压力引起的快速翻译阻滞。压力引起的转录下调发生在RNA聚合酶II（Pol II）的启动子近端区，该区域的负延伸因子(NELF)复合体可以限制Pol II的流动，并进一步破坏RNA延伸。
——结果——
1. 人类转录因子NELF在压力条件下形成核凝聚物
热休克胁迫导致整体转录下调，可以通过RNA PolII的ChIP信号降低来观察。作者观察到在下调基因的启动子处NELF结合增加(图1A)。与此相一致的是，热休克胁迫导致染色质相关NELF复合体丰度增加(图1B)。值得注意的是，荧光标记的NELFA蛋白亚基在热刺激30分钟内重组为明亮的核斑点(图1C)。并且这些核斑点具有类似液体的性质, 能够进行荧光漂白恢复(图1D)，并可以融合形成更大的球形点状物(图1E)。NELF核斑点对1,6-己二醇处理高度敏感 (图1F和1G)。因此，人类NELF复合体在压力下迅速形成液体状凝聚物，伴随NELF染色质招募和整体转录下调。
图1. 压力诱导细胞核中的转录因子NELF凝聚。
2. 重组NELF在体外进行相分离
重组NELF液滴对离子强度的增加很敏感(图2A)，表明NELF LLPS在体外需要静电相互作用。在氯化钠浓度为50 mM时，NELF形成的液滴临界浓度为≈0.5 uM(图2B)。NELF液滴接触时可以合并成更大的液滴(图2C)，荧光漂白后可以快速恢复(图2D)，表明NELF分子可以在凝聚相内自由扩散，这些结果表明纯化的NELF复合物可以在体外发生LLPS。
图2. 重组NELF在体外进行液-液相分离。
3. 去磷酸化是NELF相分离所必需的
接下来，作者研究了为什么只在应激条件下才能观察到NELF凝聚。在热休克刺激下，NELFA蛋白的三个氨基酸残基磷酸化水平持续下降(图3A)。已知NELF残基在体内被P-TEFb激酶CDK9亚基磷酸化。为了研究P-TEFb介导的磷酸化在NELF缩合中的作用，作者将NELF液滴与活性的野生型(WT)或催化活性的P-TEFb复合体孵育。时间分辨成像显示，野生型的P-TEFb处理NELF液滴时显著收缩，而催化激活的P-TEFb变体则没有观察到任何变化(图3B)。为了进一步测试磷酸化对NELF相分离的影响，作者对去磷酸化或P-TEFb处理的NELF液滴进行了FRAP分析。在光漂白整个液滴后，大约80%磷酸化的NELF分子在20分钟内与周围的溶液交换，而在同等大小的液滴中，只有40%去磷酸化的NELF分子恢复。对P-TEFb的激酶亚基即CDK9进行了定量相互作用组分析发现，热休克导致CDK9与LARP7、HEXIM1和MEPCE的相互作用显著增加(图3E)。表明热休克导致CDK9隔离，可能促进NELF去磷酸化和缩合。
图3. NELF相分离需要NELF去磷酸化。
4. 压力诱导的SUMO化是NELF凝聚所必需的
DRB抑制CDK9不会导致NELF凝聚物的形成(图4A)，表明仅仅降低NELF磷酸化水平不足以驱动细胞NELF相变。此外，作者发现热休克导致NELF复合物的30多个残基的小泛素样修饰体(SUMO)改变，用SUMO激活酶1/2 (SAE1/2)抑制剂ML-792处理细胞，NELF凝聚物数量减少(图4B和4C)。siRNA下调SUMO结合E2酶UBC也降低了NELF凝聚物比例(图4D和4E)。ZNF451的消耗减少了NELF的凝聚，其程度与UBC9的消耗相似(图4F)。总的来说，这些数据表明热休克诱导的SUMO化对NELF凝聚是至关重要的。
图4. NELF SUMO化驱动核凝聚物的形成。
5. NELF触须驱动相分离，并在体外与Pol II CTD相互作用
NELFA和NELFE都含有被称为“触角”的IDR(图5A)。GFP融合到NELFA或NELFE触须上时均未发生相分离(图5B)。然而，当GFP-NELFA触手融合蛋白与GFP - NELFE触手融合蛋白以等摩尔比例混合时，液滴很容易形成(图5C)。GFP在其N端或C端与NELFE触手融合，即使在低得多的浓度下仍然可以产生相分离(图5D)。所得液滴对1,6-己二醇敏感(图5E)。重要的是，NELF复合突变体在既没有NELFA也没有NELFE触须时，形成液滴的能力大大降低(图5F)。这些数据表明NELFA和NELFE无序触须是NELF复合体LLPS的必要和充分的关键决定因素。
在磷酸化条件下，Pol II的C端无序结构域(CTD)可与多种转录因子的IDRs形成同型和异型相互作用。NELF液滴中富集人类CTD (hCTD)(图5G和5H)表明NELF凝聚物确实可以与Pol II CTD形成异型相互作用。hCTD的近端大部分包含与Y1S2P3T4S5P6S7一致的重复序列(图5G)，hCTD的远端一半有非重复序列组成(图5G)，远端hCTD一半在NELF液滴中富集 (图5H)。另外s5磷酸化的肽比其他测试的CTD肽在NELF液滴中更加富集(图5I和5J)。
图5. NELF无序触须在体外驱动相分离。
6. NELFA的一个天然无序区驱动细胞内的NELF凝聚，转录下调，并在应激胁迫下存活
通过对NELFA触须进行缺失诱变，从残基321到460鉴定出一个连续的无序区（IDR）。缺失IDR的NELFA(NELFA-ΔIDR)，虽然显示出对细胞核的正常靶向，但与野生型相比，NELFA-ΔIDR未能在热休克条件下形成凝聚物(图6A)。热休克导致下调基因启动子处NELFA-WT的CHIP信号增加(图1A和6B)；然而，在NELFA-ΔIDR蛋白中却没有出现这种增长，而且不下调与生长，生物合成相关的基因（图6C）。为了建立NELF凝聚及其胁迫相关功能之间的因果关系，作者将NELF - ΔIDR与不相关蛋白的IDRs融合，这些替代结构包含来自FUS或EWSR1的IDR，这两个蛋白即使在非热休克条件下也是相分离的，有趣的是，即使在没有任何应力的情况下，NELF-IDR替换物也会形成冷凝物(图6E和6F)。此外，与非胁迫条件下的NELFA- WT细胞相比，用FUS-或EWSR1-IDRs表达NELFA的细胞显示出转录降低(图6G)。重要的是，与NELFA-ΔIDR细胞相比，表达NELFA-IDR替代的细胞在热休克时表现出明显更好的存活率(图6H)。这些观察结果表明，NELF形成凝聚物可以帮助在应激胁迫时下调转录，促进细胞生存。
图6. NELFA天然无序区驱动应激诱导的NELF核凝聚，转录下调，以及应激胁迫下细胞生存。
——小结——
转录调节因子NELF在人类细胞中形成压力诱导的核凝聚，NELF的凝聚物受到蛋白磷酸化和SUMO化调控，NELFA的天然无序区是驱动核凝聚的必要条件，NELF核凝聚在应激条件下下调转录以促进细胞生存。总之，本文报道了一种压力诱导的核凝聚，可能有助于解释细胞在压力条件下的生存策略。
参考文献：
R. Prashant, et al. "Stress-Induced Nuclear Condensation of NELF Drives Transcriptional Downregulation." Molecular cell (2021): 81. DOI:10.1016/j.molcel.2021.01.016 (2021).
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