2023年8月26日，本课题组在WIREs Computational Molecular Science上发表了题为“Rational drug design targeting intrinsically disordered proteins”的综述文章1，北京大学化学与分子工程学院博士研究生王瀚平和熊若尧为共同第一作者，来鲁华教授为通讯作者。文章对无序蛋白构象系综的表征、模拟手段，无序蛋白与蛋白/小分子配体互作的特点，以及针对直接结合无序蛋白的小分子药物发现和优化策略进行了系统总结、讨论和展望。无序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）指一类在生理条件下不具有固定三维结构的蛋白质。无序蛋白的序列缺乏疏水与芳香残基，富含极性残基，这赋予了其高度动态和异质性的结构特点。无序蛋白具备高特异性低亲和力结合、翻译后修饰位点丰富等优势，因而在细胞内广泛参与到信号转导和转录调控之中。这类蛋白在人类蛋白质组中占比超过30%，与癌症等多种疾病的发生发展密切相关，是潜在的药物靶标。目前，已有一些直接靶向IDPs的小分子配体进入临床试验。理解无序蛋白的结构与功能关系依赖于对IDPs构象系综的解析（图1），本节会简要介绍可用于获取IDPs结构的实验与计算手段。圆二色谱（Circular dichroism, CD）。CD可表征蛋白质的二级结构，用于区分IDPs与有结构蛋白。核磁共振波谱（Nuclear magnetic resonance, NMR）。多种NMR联合可以检测异质性构象系综的多种性质，提供IDPs构象的瞬时二级结构倾向、瞬时互作和长程互作等信息。小角X射线散射（Small angle x-ray scattering, SAXS）。SAXS可以提供IDPs的回转半径和无序程度等信息。单分子荧光。荧光相关光谱（Fluorescence correlation spectroscopy, FCS）可以提供IDPs的水合半径与分布等信息。荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET）可以提供两染料间距离的分布，进而表征IDPs构象的异质性和动态性等信息。高速原子力显微镜（High-speed atomic force microscopy, HS-AFM）。HS-AFM可以可视化IDPs的形状、大小与动态变化，估算无序区的残基数量。除了以上几种方法，本课题组与郭雪峰课题组合作成功将单分子电信号的检测应用于无序蛋白构象变化以及互作的检测之中2。基于力场的方法。适用于IDPs力场的发展与增强采样的应用使得通过全原子模拟获取无序蛋白构象系综成为可能，合适的力场与水模型的搭配可以给出与实验数据契合的IDPs构象系综。MD还可用于分析翻译后修饰和突变对于IDPs构象的改变，为其功能受到的调控提供解释。基于AI的方法。基于transformer和GAN构建的idpGAN模型可以生成与MD模拟给出的构象系综性质相符的IDPs骨架构象系综。除了传统的力场方法，考虑到IDPs具有较多带电残基，可极化力场会在无序蛋白模拟中发挥重要作用。实验数据约束模拟过程或计算拟合实验结果。实验表征的信息各有局限，计算的构象真假难辨，因此要获得原子级IDPs构象系综，需要依靠两者结合的整合方法。具体而言，可以从MD模拟结果中挑选符合实验数据的构象来组成原子级IDPs构象系综，也可以用实验数据约束模拟过程来获得对应构象系综。数据库。PED和PDB等数据库收集了大量实验或实验结合计算得到的构象系综数据，这些数据可用于训练模型或检验计算方法。需要注意的是，模拟或实验研究一般只是选取IDPs中的一段无序区，而这类蛋白大多很长，由多个结构域构成，因此其他部分对于拟研究无序区的影响需要纳入考虑。另外，细胞中其他作用分子以及拥挤环境的影响也是需要考虑的因素。图1 实验与计算结合的方法可用于获取原子级无序蛋白构象系综，被收录进数据库的无序蛋白结构数据会促进实验与计算方法的发展互作网络。IDPs，尤其是转录因子蛋白，通常是互作网络的枢纽，与很多蛋白存在相互作用。一段无序区可以与多个不同蛋白结合（一对多结合），不同无序区也可以与同一个蛋白结合（多对一结合）。有观点认为IDPs可以通过改变自身蛋白水平的方式调控所属互作网络，进而影响细胞表型。互作模式。IDPs与蛋白结合时可以通过无序到有序转变（disorder-to-order transition）以明确的二级结构形成稳定复合物，也能在复合物中保持完全无序，还可以形成介于两者之间的模糊复合物（图2a）。互作机制。IDPs可以在与蛋白结合的同时进行折叠(coupled folding and binding)，很多研究观察到IDPs的结合时折叠既有诱导契合又有构象选择的贡献。互作特异性。IDPs互作的特异性部分由短线性基序（short linear motifs, SLiMs）贡献，SLiMs通常是发生无序到有序转变的区域。另一方面，与不同互作搭档结合时消除IDPs分子内次优互作（frustration）的方式也能部分解释其特异性。“蛋白云”与“配体云”。IDPs与小分子配体的互作是高度动态和多位点的（图2b），将构象叠加后类似配体点云围绕蛋白。这种互作存在序列特异性，小分子与偏好序列会有更长时间的结合和更低的结合自由能。关键残基。P53-TAD与EGCG、c-Myc bHLHZip与10074-G5、AR-NTD与EPI-001等互作的整合实验与计算分析表明小分子配体偏好结合IDPs无序区中无序程度相对更低的疏水与芳香残基。这部分残基一般位于IDPs的SLiMs上。更大的化学空间。IDPs配体应该比结合有结构蛋白的固定口袋的配体具有更大化学空间。理解IDPs的互作特征有助于明确药物设计的目的并提高效率，比如设计可以特异结合SLiMs的配体以实现对靶标IDP互作网络的精准调控。图2 （a）无序蛋白与蛋白结合时可折叠成稳定的二级结构、形成模糊复合物或保持完全无序状态；（b）小分子可结合无序蛋白的多个位点，形成动态互作实验筛选。实验筛选可以直接筛选能结合目标IDPs的配体，比如通过SPR、NMR等互作表征手段；也可以筛选具备目的功能的IDPs配体，比如通过luciferase筛能抑制转录活性的配体、AlphaScreen筛能抑制目标PPI的配体；还可以通过表型筛选和靶标验证发现IDPs配体。虚拟筛选。如图3，对于有足够配体数量的IDPs靶标，可以进行基于配体的筛选；对于有构象数据的IDPs靶标，可以进行基于系综的筛选（Ensemble-based drug discovery, EBDD）。2016年，本课题组应用EBDD方法筛选到6个可以直接结合c-Myc bHLH-Zip结构域的小分子配体，并发现IDPs配体在对接打分中具有“多构象亲和”特点。随后于2019年提出“多构象亲和策略”EBDD方法并成功应用于直接结合p53-TAD结构域的理性药物发现中。药物再利用。将已上市药物用于发现可以调控IDPs的配体。该方法可以减少药物研发的成本。共价配体筛选。可以基于配体优先策略，共价头优先策略，也可以通过基于活性的蛋白质分析（Activity-based protein profiling, ABPP）等组学方法进行筛选。值得注意的是，目前已发现IDPs共价配体的无共价头前体均有一定结合活性。偶然发现。药物发现有一定运气成分。然而，对于无序蛋白而言，IDPs并不一定是全长无序，部分有活性的、预期结合有序区的化合物，实际可能结合的是无序区，因此对有活性化合物的结合位点鉴定十分必要。除了以上几种方法，PROTACs和基于液液相分离表型的筛选也是有效IDPs配体发现策略。“不管黑猫白猫，抓住老鼠就是好猫”，由于靶向IDPs药物发现的困难性，若想发现能直接结合IDPs的候选药物，应该因地制宜，根据靶标功能、目的和具备的实验条件选择合适的策略。对于“多构象亲和策略”3, 4而言，关键在于：1）获取尽可能真实的IDPs构象系综，2）从中挑选出可药构象与口袋以进行对接，3）选择候选化合物时，挑选能与多个可药构象打分都高的（highly ranked across multiple conformations）分子，这一点明显区别于挑选只能与单一构象打分最高（the best to one conformation）或能与很多构象打分平均值高（the average to many conformations）的挑选方法。图3 靶向无序蛋白的理性药物设计方法。（a）基于配体的药物发现策略，（b）基于构象系综的药物发现策略，（c）共价筛选策略基于SAR的优化。传统的构效关系分析仍然可以应用于IDPs配体优化。不过，缺少结构信息辅助加上配体改造导致的互作模式变化使得SAR效率不高，且难以明显提高亲和力。计算辅助的优化。MD模拟可以提供原子级复合物结合信息，从中可以分析IDPs与配体的结合模式，进而为优化提供结构辅助。不过，目前适用于IDPs复合物的MD轨迹分析方法有限，还需要进一步发展才能提供指导性意见。除此之外，其他可能有效的优化策略还包括：1）已知真实结合模式且结合位点有可共价残基的条件下，在配体上引入共价头；2）用配体诱导IDPs构象变化，使用被诱导的构象进行筛选与改造；3）揭示IDPs与配体结合时对亲和力起更多贡献的主要构象，用这些主要结合模式辅助进行基于结构的优化。AR配体EPI系列。EPI系列化合物始于2010年，于2015首次进入临床，现在该系列的二代化合物处于两个临床试验（ClinicalTrials.gov Identifier:NCT04421222, NCT05075577）之中。该系列进入临床离不开Sadar课题组十多年的坚持不懈和AR配体研究对于化合物体内活性的重视。c-Myc配体omomyc和WBC100。c-Myc在2003年已有无序区配体，但直到2021年才有配体进入临床。其中omomyc（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04808362）是多肽配体，WBC100（ClinicalTrials.gov Identifier: NCT05100251）是分子胶。对比AR与c-Myc的药物发展，可以发现c-Myc的早期配体在蛋白水平和细胞水平活性好，但体内活性很差；联系c-Myc的C端与AR的N端功能，推测原因可能在于结合c-Myc C端以抑制其与DNA结合进而调控转录作用的方式或许不如对转录因子互作网络的调控有效，不过大幅影响转录因子互作网络也意味着配体可能具有更高的毒性。无序蛋白的存在扩展了蛋白质“序列-结构-功能”关系范式，对表征技术提出了更高要求，促进了力场的发展。而当今基于AI的方法开始在IDPs研究中崭露头角，未来深度学习与蛋白大语言模型将会成为揭示IDPs序列、结构与结合特征关系的有利工具，这将为IDPs药物设计带来新的思路。无序蛋白参与无膜细胞器的形成，也调控着复杂的互作网络，与诸多疾病相关，对IDPs功能与生物学机制的深入理解将为疾病治疗提供更多策略。总之，靶向无序蛋白药物设计是一个快速发展和重要的领域，我们期待着一个无序蛋白能被彻底理解和应用的时代的到来。1.Wang H, Xiong R, Lai L. Rational drug design targeting intrinsically disordered proteins. WIREs Comput Mol Sci. 2023. e1685. https://doi.org/10.1002/wcms.1685
2.Liu W, Chen L, Yin D, Yang Z, Feng J, Sun Q, et al. Visualizing single-molecule conformational transition and binding dynamics of intrinsically disordered proteins. Nat Commun. 2023;14(1):5203.
3.Yu C, Niu X, Jin F, Liu Z, Jin C, Lai L. Structure-based inhibitor design for the intrinsically disordered protein c-Myc. Sci Rep. 2016;6:22298.
4.Ruan H, Yu C, Niu X, Zhang W, Liu H, Chen L, et al. Computational strategy for intrinsically disordered protein ligand design leads to the discovery of p53 transactivation domain I binding compounds that activate the p53 pathway. Chem Sci. 2021;12(8):3004-16.
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