在过去的十年中,等温扩增(如HCA、MDA和环介导等温扩增LAMP)在即时护理(POC)诊断中发挥了越来越重要的作用。
等温扩增具有与qPCR相似的灵敏度和特异性,但是在快速、低成本和便携性方面具有优势,因此成为在资源有限环境下可用来进行现场检测的理想选择。
LAMP反应产物的检测方法包括:电泳法、浊度法和染料法,其中电泳法和浊度法是终点检测法,而染料法现在更为常用,可实现实时检测。
LAMP染料法中用的染料包括两种:
荧光染料:自发光荧光染料和嵌合型荧光染料
比色染料 (colorimetric dye):pH指示剂
本文整理了近十年来常用的几种染料,供各位同仁开发LAMP检测试时参考选择。
荧光染料
常见的自发光荧光染料有: 羟基萘酚蓝HNB和钙黄绿素Calcein。
羟基萘酚蓝(HNB)
一种金属离子指示剂, 变色原理为:HNB与镁离子结合使得反应体系初始颜色为紫罗兰色,随着反应的进行,Mg2+与析出的焦磷酸根离子反应生成焦磷酸镁沉淀,羟基萘酚蓝失去了镁离子使得体系颜色变为天蓝色,而未反应的体系则仍保持着紫罗兰色 。
钙黄绿素(Calcein)
常见的嵌合型荧光染料有:Sybr Green,EvaGreen,Syto。这一类染料会渗入到DNA双链的小沟中,与双链DNA结合以后,荧光信号会增强 800~1000倍。
↓常见的荧光染料整理对比↓
(点击看大图)
不同浓度荧光染料对LAMP检测的灵敏度对比
当然,通过把荧光染料滴加在反应管的管盖上,反应结束以后,将染料弹入或离心与反应体系混匀,这种操作方式可以避免Sybr Green对反应效率的影响以及产生气溶胶污染。
荧光染料法可以通过将染料加入到反应中从而实现实时和视觉检测,适合用于要求高灵敏度的POC检测中。
比色染料
LAMP反应在合成DNA的过程中,释放的副产物包括焦磷酸根和氢离子,因此反应液的pH值会随着反应进行而产生变化,由初始碱性变为酸性,如此显著的pH值变化为探测LAMP反应产物提供了另一种可能,即通过使用pH敏感指示剂作为染料检测DNA扩增,实现肉眼对扩增结果可视化的判断,区分阳性和阴性结果。
使用pH指示剂为染料的反应要求反应液低缓冲度(低浓度Tris),pH值8.8以上。pH指示剂染料浓度在50-100uM/反应(2)。
常用在LAMP反应中的pH指示剂为:
酚红(phenol red),甲酚红(cresol red):红色变黄色
中性红(neutral red):淡橙色变为粉红色
甲酚紫(cresol purple):淡紫色变为黄色
不同pH指示剂在LAMP反应中的颜色变化
使用pH指示剂作为染料的方法,让低成本、便携式的快速LAMP检测更容易实现和普及,但是,pH染料指示剂不使用所有等温扩增方法,例如解旋酶依赖性扩增(HAD)。
产品编号 | 产品名称 |
MDX012 | Bst DNA聚合酶 |
MDX018 | 可冻干Bst DNA聚合酶 |
MDX019 | 抗抑性Bst缓冲液 |
MDX076 | Bst反应缓冲液 |
MDX078 | Bst酶稀释液 |
MDX097/108 | 可冻干 LAMP/RT-LAMP预混液 |
MDX118/119 | 可风干 LAMP/RT-LAMP预混液 |
MDX124/125 | 可冻干血液直扩 LAMP/RT-LAMP预混液 |
MDX134/135 | 可冻干唾液直扩 LAMP/RT-LAMP预混液 |
MDX144/145 | 可冻干粪便直扩 LAMP/RT-LAMP预混液 |
MDX910 | 可冻干RT-LAMP预混液 (比色法) |
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参考资料:
1. https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2019.02234/full
2. https://www.future-science.com/doi/10.2144/000114253
3. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6803449
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