导 读
不同的人群在患有新型冠状病毒肺炎(COVID-19)后的症状各不相同，患病后的疾病的严重程度也有很大差异，分为轻症、中症、重症或危重症。加深对 SARS-CoV-2 如何影响宿主及其微生物群的理解，并确定疾病症状严重程度的预测因子，可以大大改善疾病管理和有限的医疗资源的分配。已发表的研究表明 COVID-19 的严重程度与年龄、吸烟、性别以及基础疾病(高血压)等因素相关联。中山大学附属第五医院庞鹏飞教授团队在《frontiers in microbiology》(IF=4.259) 杂志发表了一项研究，华大基因感染科研团队的闵久梦、祝中一、何香燕也参与了此次研究。该研究对在医院接受治疗的 COVID-19 患者的鼻咽、口咽、肛门拭子进行了宏转录组测序，并从不同疾病严重程度，不同性别方面进行数据研究和分析。展示了新冠肺炎患者及其微生物群中的基因表达，以确定潜在的生物标记物，从而帮助疾病管理。
研
究
结
果
1
与COVID-19严重程度相关的患者特征
该研究样本取自2020 年 1 月 17 日至 2020 年 3 月 21 日期间在医院诊断为 COVID-19的 125 名患者的 129 份 RNA 样本，其中 102 名 (82%)为轻度症状(包括 21名轻症和 81 名中症)，23 名(18%)为重度症状(分别包括 17 名重症和 6 名危重症)。临床统计比较了轻度症状患者和重度症状差异，发现重度症状患者年龄在52-78 岁(平均年龄 61.91 ± 5.52 岁)并且男性数量更多。正向逐步多变量分析(Forward stepwise multivariate analysis)确定 D-二聚体浓度作为 COVID-19 严重程度的独立预测因子(OR 14.248，95% CI 2.985–68.005)。
表1 与COVID-19患者疾病严重程度相关的临床人口学特征
2
COVID-19患者三种取样部位拭子的微生态
对COVID-19患者的129 个 RNA 样本进行了宏基因组测序。在肛门组中检出菌属393个，鼻咽组中检出菌属330个，口咽组中检出菌属1253个；α多样性显示口咽组中的物种丰度显著高于其他两组(P<0.01)。肛门组和鼻咽组没有显著差异(P = 0.074)。主成分分析 (PCA) 检测到口咽组中的微生物 β 多样性与鼻咽组和肛门组存在显著差异(P = 0.001)，但鼻咽组和肛门组没有显著差异(P = 0.181)。数据表明，口咽组中的微生物菌属比鼻咽组和肛门组中更丰富。比较了三种拭子中SARS-CoV-2病毒的RNA检测阳性率，发现口咽组检出率最高(检测阳性率=0.60)，同时发现RNA reads数量与循环阈值 (Ct) 负相关(皮尔逊系数 –0.55733)，表明 SARS-CoV-2 读数和病毒载量之间呈正相关。
图1 COVID-19患者不同取样部位的微生物菌群比较分析
3
COVID-19轻症或重症患者的微生物菌群差异
COVID-19轻症或重症患者的微生物菌群比较发现，随着疾病严重程度的增加，微生物菌群的物种水平 α 多样性逐渐降低。此外，PCA 证实了微生物菌群多样性的这种差异，并且随着 COVID-19 患者症状的加重，微生物多样性缓慢变化(PC1 P = 0.0564)。在肛门拭子组中，重症组中四个属的 12 种细菌物种的丰度降低，三个属的 19 种细菌物种的丰度增加。在鼻咽拭子组中，重症组中棒状杆菌属或角质杆菌属的 11 种细菌的丰度降低，芽孢杆菌或弧菌属中20种的丰度增加。在口咽拭子组中，重症组中 7 个属的 38 种细菌物种的丰度降低，以及 4 个属的 38 种细菌物种的丰度增加。
图2 不同严重程度的COVID-19患者的微生物菌群多样性比较分析
4
COVID-19轻症或重症患者基因表达的差异
通过Spearman在宿主基因表达与COVID-19患者严重程度之间进行了相关性分析。在肛拭子组中，一些基因的表达(Fisher检验 P < 0.05)涉及转运和分解代谢(内吞作用)、感觉系统(嗅觉转导)、转录(RNA 聚合酶)和免疫系统(胞质 DNA 传感通路)与疾病严重程度呈负相关。相反，一些基因的表达(Fisher 检验 P < 0.05)涉及人类内分泌和代谢疾病、传染病和内分泌系统疾病(醛固酮合成和分泌、皮质醇合成和分泌)与疾病严重程度呈正相关。在鼻咽拭子组中，重症与免疫系统和代谢(碳水化合物、辅因子、维生素和核苷酸)的一些基因的下调相关(P<0.05，Fisher 检验)。然而，口咽拭子组中没有找到表达基因与疾病严重程度相关。并比较了轻症和重症组之间的宿主基因表达发现，在肛门拭子组的重症组中有36个基因上调，48个基因下调。GO功能富集在细胞凋亡执行和精子发生，以及蛋白质修饰。在鼻咽拭子组的重症组中有43个基因上调，42个基因下调，GO功能富集在细胞凋亡执行和精子发生以及细胞分解代谢、核小体组装和细菌防御反应。在口咽拭子组的重症中，有 35 个基因上调，GO功能富集在雌激素依赖性基因表达和免疫系统中的细胞因子信号，蛋白质修饰。
图3 轻症和重症COVID-19患者中宿主和微生物基因表达和功能富集分析
5
COVID-19轻症或重症微生物基因表达差异
轻症组中的微生物基因表达显示出更高水平的翻译起始、蛋白质折叠和蛋白质修饰。相反，重症组中的微生物基因表达与萜类化合物和聚酮化合物的代谢，包括铁载体基团的生物合成；外源生物降解和代谢，包括己内酰胺、二甲苯、苯甲酸盐和氟苯甲酸盐的降解。这表明重症 COVID-19患者的微生物组比轻度疾病患者的微生物组显示出更活跃的药物代谢。
6
不同性别的COVID-19微生物多样性和
宿主基因表达差异
在 PCA或 α-多样性和 β-多样性测试(Pα = 0.39，Pβ = 0.22)中，男性和女性患者的微生物组成没有显著差异。但在三种不同取样部位的拭子中，宿主转录组在男性和女性之间存在显著差异。男性和女性患者前 200 个基因差异表达GO功能富集在与性激素相关的配子生成和性腺中胚层发育。在肛门拭子组中，21 个基因在男性和重症患者中均高表达；这些基因功能富集在细胞凋亡执行和精子发生。在鼻咽拭子组中，16 个基因在男性和重症患者中均高表达，这些基因功能富集在泛素特异性加工蛋白酶和精子发生。在口咽拭子组中，7 个基因在男性和重症患者中均高表达，但功能富集没有结果。
图4 不同性别的COVID-19微生物多样性和宿主基因表达分析
7
生物分子标记预测COVID-19的严重程度
使用随机森林模型来确定在不同取样部位拭子中轻症和重症患者之间的宿主差异表达基因预测 COVID-19 的严重程度。选择与疾病严重程度相关的前 20 个差异表达基因作为候选的生物分子标记。在肛门拭子组中，这些分子标记的ROC的AUC值为 0.83 到 0.89，基PCA 聚类显示轻症和重症患者的完全分离。在鼻咽拭子组中，这些分子标记的ROC的AUC值在 0.79 到 0.92 之间，PCA的聚类显示轻症和重症患者的完全分离。口咽拭子组中的分子标记也观察到了类似的结果，ROC的AUC值为 0.70 至 0.78。而通过正向逐步多变量分析确定与严重程度相关的独立预测因子的 D-二聚体浓度进行评估得到其ROC的AUC值为 0.881，与我们的生物分子标记的预测能力相当。
另外在重症组中，X 染色体上的分子标记，在肛门拭子组中，口咽拭子组和鼻咽拭子组中的数量分别为 4 个，14 个和4 个，在所有三种类型的拭子中为 9 个。在肛拭子组中，发现位于X染色体上的两个基因与疾病严重程度呈正相关，即CT47A8和CT47A4，均属于癌症/睾丸抗原家族。在口咽拭子组中，位于 X 染色体上的大多数生物分子标记(14/20)与症状的严重程度呈负相关，包括 TCP11 × 2(t-complex 11 家族成员)，这是精子形态的潜在决定因素。和两个免疫相关基因，即 GAGE12G(G 抗原)和 MAGED2(MAGE 家族成员)。同时，发现 X 抗原家族成员 XAGE1A 与鼻咽拭子组中的疾病严重程度呈负相关。在总共三种类型的拭子中，我们发现一些位于 X 染色体上的免疫相关基因与症状的严重程度呈负相关，例如 GAGE12F(G 抗原 12F)、TNMD(tenomodulin)、MAGEA6(MAGE 家族成员)和 MAGED2(MAGE 家族成员)，这进一步证明了 COVID-19 的疾病严重程度存在性别差异。
图5 肛门拭子组中预测COVID-19严重程度的生物分子标记
结 语
轻度或重度新冠肺炎患者之间的几种微生物菌株数量存在差异。口咽拭子中的微生物属比鼻咽拭子或肛门拭子中更丰富。来自轻症患者的拭子中的微生物和人类转录组分别显示了与氨基酸代谢或通过小蛋白去除进行蛋白修饰和抗菌防御反应相关的基因的富集，而来自重症患者的标本显示了与药物代谢、细胞凋亡执行的负调节、精子发生和免疫系统相关的基因富集。
男性和女性之间的微生物丰度和多样性没有显著差异。X染色体上几个宿主基因的表达与疾病严重程度呈负相关，如GAGE12F(G 抗原 12F)、TNMD(tenomodulin)、MAGEA6(MAGE 家族成员)和 MAGED2(MAGE 家族成员)。通过这种方式，分析确定了宿主基因的差异表达可以帮助诊断COVID-19，并通过非侵入性分析预测其严重程度。
联系客服
