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论文ID
实验设计
实验结果
作者首先评估了110名CRC患者及112名健康人群肠道中肠道罗斯拜瑞氏菌的丰度。与健康人群相比，CRC患者粪便样本中的肠道罗斯拜瑞氏菌显着减少。为了进一步验证这一结果，作者检索了四个已发表的宏基因组数据集（包括334名CRC患者和463名健康对照）中肠道罗斯拜瑞氏菌的丰度。在所有CRC患者队列中，肠道罗斯拜瑞氏菌均显著减少，从而证实了在CRC中肠道罗斯拜瑞氏菌的减少。
作者首先在ApcMin/ 小鼠中评估了肠道罗斯拜瑞氏菌在CRC肿瘤发生中的作用。作者通过灌胃的方式给予ApcMin/ 小鼠肠道罗斯拜瑞氏菌、大肠杆菌MG1655或PBS 6周（图1A），结果显示与大肠杆菌或PBS处理小鼠相比，肠道罗斯拜瑞氏菌处理显著降低了小鼠结肠肿瘤的发生（图1B、C）、肿瘤数量和面积（图1D)。此外，肠道罗斯拜瑞氏菌处理小鼠的发育不良评分也较低，肿瘤及非肿瘤结肠组织中的Ki-67阳性细胞数均显着减少（图1E）。然而，小鼠的体重、肝功能（血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶）和肾功能（血清血尿素氮和肌酐）在肠道罗斯拜瑞氏菌处理后并没有显著改变。
为了进一步验证，作者又使用了另一种AOM诱导的CRC小鼠模型，并给予 肠道罗斯拜瑞氏菌30周（图1F）。结果与在ApcMin/ 小鼠中发现的结果一致，与对照组相比，肠道罗斯拜瑞氏菌显著降低了结直肠肿瘤的发生（图1G、H）、肿瘤数量和面积（图1I），在肠道罗斯拜瑞氏菌处理的AOM小鼠中也观察到了发育不良评分和Ki-67阳性细胞数的减少（图1J）。总的来说，作者从两个CRC小鼠模型中获得的一致结果证明了肠道罗斯拜瑞氏菌对结直肠肿瘤发生的抑制作用。
众所周知，肠屏障功能障碍在结直肠癌的发生发展中发挥着关键作用。因此，作者检查了肠道罗斯拜瑞氏菌处理后ApcMin/ 小鼠的肠屏障完整性。结果显示血清异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖水平显著降低，这证明了肠道罗斯拜瑞氏菌显著降低了肠道通透性（图2）。与大肠杆菌或PBS处理小鼠相比，肠道罗斯拜瑞氏菌处理小鼠的结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和claudin-3的表达显著增加（图2B）。IHC染色结果也证实了结肠组织中这些基因的上调（图2C）。综上所述，肠道罗斯拜瑞氏菌可以改善CRC小鼠的肠屏障功能。
为了研究肠道罗斯拜瑞氏菌抑制肿瘤的机制，作者首先将人结直肠癌细胞系 HCT116、LoVo、SW480以及正常结肠上皮细胞系NCM460与活的或经过巴氏灭菌的肠道罗斯拜瑞氏菌、大肠杆菌或正常培养基进行共培养。然而，无论是活的还是巴氏灭菌后的肠道罗斯拜瑞氏菌对结肠癌细胞的活力影响没有任何差异，表明肠道罗斯拜瑞氏菌本身对CRC细胞的生长没有影响。因此，作者推测肠道罗斯拜瑞氏菌的肿瘤抑制作用归因于其衍生物，并使用肠道罗斯拜瑞氏菌的培养基（CM）来处理CRC细胞。肠道罗斯拜瑞氏菌CM (5% vol/vol)显著抑制了CRC细胞HCT116、LoVo及SW480的活力，但不抑制正常结肠细胞系NCM460的细胞活力（图3A）。同样，肠道罗斯拜瑞氏菌CM处理减少了CRC细胞集落的形成（图3B）和增殖（图3C），但增加了CRC细胞的早期和晚期凋亡（图3D），以及凋亡标记蛋白[裂解的caspase-7和裂解的多聚ADP核糖聚合酶（PARP）]的表达（图3E）。肠道罗斯拜瑞氏菌CM还抑制了CRC细胞中细胞周期G1-S相变、增加了G0/G1期比例、减少了S期比例（图3F）。与此一致，肠道罗斯拜瑞氏菌CM降低了细胞周期标记物CDK6的蛋白表达，并增加了p27 Kip1的蛋白表达（图3G）。此外，肠道罗斯拜瑞氏菌CM显著抑制了CRC患者来源的类器官的生长（图3H）。总而言之，这些结果表明肠道罗斯拜瑞氏菌产生的分子抑制了CRC细胞系和患者来源的类器官的生长。
为了确定肠道罗斯拜瑞氏菌产生的功能性抗肿瘤分子，作者将肠道罗斯拜瑞氏菌CM分成了分子量 < 3 kDa和 > 3 kDa的两个不同部分。作者发现，只有 < 3 kDa的肠道罗斯拜瑞氏菌CM对所有三种CRC细胞系HCT116、LoVo和SW480表现出了抑制作用，但对正常上皮细胞系NCM460没有抑制作用（图4A）；在 >
3 kDa的肠道罗斯拜瑞氏菌CM中未观察到这一点。因此，作者使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的方法对 <
3 kDa的肠道罗斯拜瑞氏菌CM进行了分析（非靶向代谢组学分析），与肉汤对照相比，丁酸成为差异最大的代谢物之一（图4B）。随后使用气相色谱-质谱(GC-MS)进行短链脂肪酸(SCFA)靶向代谢组学分析，确认了在 < 3 kDa的肠道罗斯拜瑞氏菌CM中，丁酸的浓度大幅增加至2000 µg/mL（图4C），此外，作者在接受肠道罗斯拜瑞氏菌补充的ApcMin/ 小鼠和AOM小鼠粪便中检测到了丁酸水平的升高，进一步证实了这一点（图4D）。
随后，作者在体外评估了丁酸的直接抑制作用。作者使用5% 肠道罗斯拜瑞氏菌CM（丁酸的相对浓度为1 mM）处理CRC细胞，结果显示CRC细胞的生长受到了显著的抑制（图4E），同时细胞凋亡增加（图4F），G1-S期相变受到抑制（图4G）。除丁酸外，非靶向代谢组学分析还表明肌苷为肠道罗斯拜瑞氏菌CM（<3 kDa）中的最高差异富集代谢物。肠道罗斯拜瑞氏菌CM中肌苷的浓度约为8 µg/mL。然而，肠道罗斯拜瑞氏菌CM中此剂量的肌苷对CRC细胞的生长没有显著的抑制作用。
作者进一步测试了肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸与人类结直肠癌患者结直肠肿瘤发生的关系。作者对内部队列中的118名CRC患者和128名健康人群的粪便样本进行了代谢组学分析，证实了CRC患者中丁酸的显著减少。在该队列的CRC患者中也观察到了肠道罗斯拜瑞氏菌的显著减少。总的来说，这些发现表明丁酸是肠道罗斯拜瑞氏菌发挥肿瘤抑制功能的主要代谢物。
从已发表的宏基因组数据集中，作者发现与258位对免疫检查点阻断治疗无应答的患者相比，在75位对免疫检查点阻断治疗显著应答的患者的粪便中肠道罗斯拜瑞氏菌显著增多。因此，作者进一步测试了肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸是否可以增强结直肠癌免疫治疗的效果。原位注射小鼠CRC细胞系MC38（MSI-High）3天后，作者通过口服灌胃的方式给予小鼠肠道罗斯拜瑞氏菌、丁酸钠或大肠杆菌，并在肿瘤形成后开始抗PD-1治疗（图5A）。肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠均显著抑制了MC38原位肿瘤的生长（图5B-D）。接受抗PD-1单一疗法的小鼠其肿瘤生长也受到抑制，而抗PD-1与肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠联合治疗并没有进一步增强抗PD-1的疗效。对MC38原位CRC小鼠进行肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠治疗后，作者发现浸润性CD8 T细胞（图5E）和细胞毒性CD8 T细胞（可以分泌颗粒酶B、IFN-γ及TNF-α的CD8 T细胞）均增多（图5F)，同时髓系来源的抑制性细胞(MDSC)减少（图5G）。已知MC38同系移植CRC小鼠具有高MSI且具有良好的免疫治疗反应。本研究结果表明，在高MSI型同系移植CRC小鼠中，肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸具有与抗PD-1疗法相似的肿瘤抑制功效。
然后，作者进一步验证了肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸是否对CT26同系移植CRC小鼠也有作用（这是一种微卫星稳定型（MSS）小鼠模型，并且该小鼠具有遗传性免疫治疗耐药性）（图6A）。正如预期的那样，CT26同系移植CRC小鼠对抗PD-1治疗不敏感（图6B-D）。与抗PD-1治疗和对照组相比，肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠治疗使肿瘤的重量（图6C）和肿瘤大小（图6D）均显著减少。此外，肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠与抗PD-1疗法的组合治疗进一步协同了肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠的抗肿瘤作用（图6B-D）。同时，在接受肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠单一治疗的同系移植CRC小鼠模型中，浸润性CD8 T细胞（图6E）和细胞毒性CD8 T细胞（可以分泌颗粒酶B、IFN-γ及TNF-α的CD8 T细胞）的比例均显著增加（图6F），并且肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠与抗PD-1疗法的组合进一步增多了这些免疫细胞的数量（图6E-F）。使用肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠（而非抗PD-1单一疗法）也降低了肿瘤中MDSC的比例（图6G）。同时，在给予肠道罗斯拜瑞氏菌或丁酸钠后，MC38和CT26同系移植CRC小鼠的粪便中丁酸的增加也得到了验证。这些结果共同表明，对于具有MSS表型的CRC小鼠模型，肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸钠可以有效的促进抗PD-1治疗的功效。
作者进一步研究了肠道罗斯拜瑞氏菌CM和丁酸如何与CD8 T细胞相互作用进而调节抗肿瘤免疫的机制。作者从人外周血单个核细胞（PBMC）或小鼠脾脏中分离了T 细胞，对其进行或不进行肠道罗斯拜瑞氏菌CM或丁酸(1 mM)处理。结果显示肠道罗斯拜瑞氏菌CM和丁酸处理均促进了CD8 T细胞产生颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α（图7A）。为了进一步了解它们与CD8 T细胞的相关性，作者在肠道罗斯拜瑞氏菌CM处理后，检测了CD8 T细胞上受体和转运蛋白的信使 RNA(mRNA)的表达，包括G蛋白偶联受体43（GPR43）、溶质载体家族6成员1（SLCL6A1）和Toll样受体1-6（TLR1-6）。肠道罗斯拜瑞氏菌CM有改变SCFAs受体或转运蛋白的表达，但改变了与效应T细胞相关的基因的表达，如DNA结合抑制因子2（ID2）、白介素2受体亚基α（IL2RA）和CD28（图7B）。特别是与大肠杆菌CM或YCFA对照处理相比，在肠道罗斯拜瑞氏菌CM处理的CD8 T细胞中，模式识别受体5（TLR5）的mRNA表达量高出10倍以上。同时，与对照相比，在丁酸处理的CD8 T细胞中TLR5的mRNA表达亦显著增高（图7C）。作者通过表面等离子体共振证实了丁酸可以与CD8 T细胞上的TLR5受体结合，亲和力为264 μM（图7D）。丁酸可以对接至TLR5的催化位点，并且复合物的最佳对接构象的结合能为-3.5 kcal/mol（图7E），这表明丁酸可以自发地结合至TLR5的活性口袋。丁酸-TLR5的物理相互作用通过下拉实验（Pull-down）得到了证实（图7F）。为了进一步验证本文发现，作者使用选择性TLR5拮抗剂TH1020来抑制CD8 T细胞中的TLR5信号传导。TH1020消除了丁酸诱导的T细胞增强反应，因为作者发现在CD8 T细胞中颗粒酶B、IFN-γ和TNF-α的产生减少了（图7G）。这些结果共同表明，肠道罗斯拜瑞氏菌CM 产生的丁酸通过直接结合CD8 T细胞上的TLR5受体来促进CD8 T细胞的活化。
NF-κB信号传导被认为是TLR5的下游通路。丁酸促进了NF-κB(p65)的核转位及其转录因子DNA的结合能力，如CD8 T细胞核提取物所示（图7H）。丁酸还增加了CD8 T细胞中磷酸-NF-κB(p65)的表达，而TH1020逆转了这种增加（图7H、I）。总之，肠道罗斯拜瑞氏菌产生的丁酸通过激活TLR5-NF-κB途径增强细胞毒性CD8 T细胞的功能。
讨论
在这项研究中，作者阐明了肠道罗斯拜瑞氏菌对结直肠肿瘤发生的保护作用。之前的研究发现，CRC患者肠道微生物群中的肠道罗斯拜瑞氏菌丰度显著降低。本研究也证实了在内部CRC队列中肠道罗斯拜瑞氏菌丰度的降低。值得注意的是，尽管多篇文献报道肠道罗斯拜瑞氏菌丰度的降低，但肠道罗斯拜瑞氏菌预防结直肠肿瘤发生的机制仍然完全未知。在这里，作者使用了两种不同的小鼠模型（ApcMin/ 小鼠模型、AOM诱导的结直肠癌小鼠模型）首次阐明了肠道罗斯拜瑞氏菌在体内的抑癌功能（图1）。此外，肠屏障功能障碍在CRC中起着至关重要的作用，其中肠道通透性增加使更多病原微生物及其衍生物更容易进入血流，从而促进微生物传播和转移。本文的结果一致表明，CRC小鼠的肠屏障受损，而补充肠道罗斯拜瑞氏菌可以显着改善肠屏障的完整性（图2）。
本研究发现肠道罗斯拜瑞氏菌的肿瘤抑制功能归因于其衍生代谢物（图3）。迄今为止，益生菌的多种抗肿瘤机制已被发现，其中一些通过分泌蛋白质衍生物表现出抗CRC作用，而包括肠道罗斯拜瑞氏菌在内的其他细菌则通过产生代谢物以减少结直肠肿瘤的发生。通过代谢组学分析，作者发现丁酸是肠道罗斯拜瑞氏菌产生的主要抗肿瘤代谢物（图4）。已知丁酸是一种与CRC发病率呈负相关的SCFA，前期的研究证明了丁酸针对结直肠肿瘤发生的多种保护机制。例如，丁酸可以在表观遗传学上充当组蛋白脱乙酰酶抑制剂来抑制肿瘤细胞增殖，而丁酸梭菌（人类肠道中主要的丁酸生产者）通过下调致癌WNT信号通路来抑制结直肠癌的发展。在这项研究中，结果清楚地表明肠道罗斯拜瑞氏菌是一种产丁酸的细菌，其衍生的丁酸可以促进肿瘤细胞的直接死亡，而对正常结肠上皮细胞的影响则很小。
本文还研究了肠道罗斯拜瑞氏菌衍生的丁酸与抗肿瘤CD8 T细胞相互作用的机制。GPR41、GPR43和GPR109A是结肠上皮细胞上负责感应丁酸和其他SCFA的主要受体。然而，作者观察到丁酸不会改变它们在CD8 T细胞上的表达。同样，之前的一项研究报告称，GPR阻断不会损害丁酸对功能性CD8 T细胞的影响。因此，这些发现表明丁酸对CD8 T细胞的影响不受GPR调控。相反，作者发现CD8 T细胞上TLR5显著上调，并通过表面等离子共振和Pull-down实验证实了TLR5是丁酸的受体（图7）。TLR5是一种在上皮细胞和免疫细胞上表达的受体，特异性识别细菌上的鞭毛蛋白，但目前缺乏报道其与微生物代谢物相互作用的研究。有研究表明肠道罗斯拜瑞氏菌可以刺激肠上皮细胞上的TLR5来抑制慢性炎症。相比之下，本文首次揭示了肠道罗斯拜瑞氏菌衍生的丁酸而不是肠道罗斯拜瑞氏菌本身可以直接与CD8 T细胞上的TLR5结合以增强其细胞毒功能。总而言之，本文的结果表明丁酸与已被充分研究的先天免疫受体之间存在新的关联，这可能为增强抗肿瘤免疫作用的新治疗策略提供理论支持。
总之，本文观察到CRC患者肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸的显著减少。通过使用多个小鼠模型，作者证明了肠道罗斯拜瑞氏菌对两种不同的CRC亚型（包括MSI-High肿瘤和MSS肿瘤）的肿瘤抑制作用。肠道罗斯拜瑞氏菌通过产生丁酸来发挥其抗肿瘤功能。肠道罗斯拜瑞氏菌和丁酸均可增强CRC中抗PD-1治疗的疗效。从机制上讲，本文揭示了肠道罗斯拜瑞氏菌衍生的丁酸与CD8 T细胞上的TLR5的直接结合，从而增强了其抗肿瘤免疫作用。因此，肠道罗斯拜瑞氏菌是一种很有前途的益生菌补充剂，它可能为提高CRC患者的治疗效果开辟一条新途径，特别是对于那些具有抗PD-1治疗耐药性的患者。
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