你见过吃塑料的虫子吗？

据10日发表在《微生物基因组学》杂志的一项研究，澳大利亚昆士兰大学的研究人员发现，常见的大麦虫（Zophobasmorio，又称“超级麦皮虫”）可以在其肠道中一种细菌酶的帮助下吞噬聚苯乙烯。这种对聚苯乙烯“有胃口”的蠕虫可能是大规模回收塑料的关键。科学家希望这种“升级版”的生物循环能带来塑料垃圾回收的新方式，从而减少垃圾填埋量。来自昆士兰大学化学和分子生物科学学院的克里斯·林克博士和他的团队在3周的时间里给大麦虫喂了不同的食物：其中一些喂了聚苯乙烯泡沫，一些喂了麸皮，还有一部分则被禁食。林克博士说：“我们发现，只喂食聚苯乙烯的大麦虫不仅存活了下来，甚至体重还略有增加。”这表明大麦虫可以从聚苯乙烯中获取能量，而且很可能是在它们肠道微生物的帮助下。研究人员使用元基因组学技术，找到了几种能够降解聚苯乙烯和苯乙烯的编码酶。他们的长期目标是设计酶，通过机械粉碎和生物酶降解，在回收工厂中降解塑料垃圾。“大麦虫就像小型回收工厂，用嘴巴撕碎聚苯乙烯，然后'喂’给肠道里的细菌。”林克博士说，“这个反应产生的分解产物可以被其他微生物用来制造高价值的化合物，比如生物塑料。”研究人员表示，他们的目标是在实验室培养大麦虫的肠道细菌，并进一步测试其降解聚苯乙烯的能力，然后研究如何将这一工艺升级到垃圾回收场所需的水平。

塑料制品在人类的生活和生产中都发挥着不可或缺的作用。然而，随着全球塑料制品生产和使用数量的急剧增加，塑料废品在环境中快速积累，已经威胁到了生态系统和人类健康。聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) 是全球最常用的合成聚合物之一，常用作食品包装、纺织纤维和一次性饮料瓶等。当前已经发现并改造了一批可降解PET的酶，包括角质酶和羧酸酯酶等。然而，现阶段PET水解酶的降解效率较低且对底物性状有较高要求，需要进一步优化改造。韩国庆北大学的Kyung-Jin Kim课题组在总结了69种PET水解酶的结构后将他们分成了I型、IIa型和IIb型三种。其中IIb型的代表就是在2016年日本东京工业大学的Kohei Oda课题组从Ideonella sakaiensis中发现的的IsPETase。该酶在环境温度下具有最高的PET降解活性。此后该酶及同类型的酶就成了研究的热点。在新发现的IIb型PET降解酶中，来自Burkholderiales bacterium RIFCSPLOWO2_02_FULL_57_36 (BurPL, BbPETase) 表现出不同于其他PETase的结构特征，其在N端有额外的143个氨基酸。近期，Kyung-Jin Kim课题组分析了BbPETase的PET降解活性及热稳定性，并阐明了该额外N端结构域对PET解聚的影响，相关研究发表在Journal of Hazardous Materials的《Structural and functional characterization of an auxiliary domain-containing PET hydrolase from Burkholderiales bacterium》一文中。一、内容

为了表征BbPETase的PET水解活性，作者表达了全长的BbPETase（BbPETaseFull）和N末端截短的BbPETase（BbPETaseCD）。BbPETaseFull和BbPETaseCD的Tm值分别为54和51°C（图1B），表明额外的N端结构域（BbPETaseAND）有助于提高酶的热稳定性。之后作者以对双（2-羟乙基）对苯二甲酸酯 (BHET)为底物检测了两种蛋白的动力学参数，BbPETaseFull 的Kcat和Km分别为分别为92.24 S-1和0.076 uM，BbPETaseCD的Kcat和Km分别为分别为104.36 S-1和0.086uM（图1C）。之后，作者以粉末化的PET瓶（mcPET，结晶度 17%）为底物检测了两种蛋白及对照IsPETase的PET降解活性，表明在30℃时，三者活性相差不大，但在40℃孵育三天后， BbPETaseFull和BbPETaseCD的产物分别比IsPETase高出了3.5倍和1.9倍（图1D）。这些结果表明BbPETase具有与IsPETase 相似的 mcPET 水解活性，并且由于其更高的热稳定性，该酶在相对较高的温度下表现出更高的水解活性。但当使用无定型PET（结晶度6%）为底物且在30℃时，该酶活性低于IsPETase（图1E），表明BbPETaseAND虽然有助于提高热稳定性，但对PET水解具有不利影响。

图1. BbPETase的 PET 降解活性。(A) BbPETase蛋白的尺寸排阻色谱分析。标准样品用灰色虚线表示。(a)为空袭体积，标准蛋白（b-f）分别为铁蛋白 (440 kDa)、醛缩酶 (158 kDa)、卵清蛋白 (44 kDa)、碳酸酐酶 (29 kDa) 和核糖核酸酶A (13.7 kDa)。(B) BbPETase 蛋白的差示扫描荧光法。显示BbPETaseFull和 BbPETaseCD的熔解温度。(C) BbPETase蛋白对BHET的动力学分析。(D)(E) BbPETase蛋白在30 °C和40 °C下对微晶PET (mcPET) (D) 和低结晶度 PET 薄膜 (lcPET) (E) 的PET降解活性。为了确定BbPETaseAND的结构和功能作用，作者使用 AlphaFold 2对 BbPETaseFull 的结构进行了建模。AlphaFold 2生成了五个模型（图2A），五个模型的核心结构域具有与BbPETaseCD的晶体结构几乎相同的结构。表明使用 AlphaFold 2 预测的BbPETase结构可能是合理的。此外，五个模型的N端结构域显示出彼此几乎相同的结构。BbPETaseAND由三个反平行的 β-折叠（β1-β12-β6-β9、β2-β5-β10-β7-β8 和 β3-β4-β11-β6）和一个 310-螺旋（η1）组成（图 2B）。对BbPETaseAND结构的Dali搜索表明该结构域在结构上与颤蛋白reelin的N端结构域相似（PDB：6A48），但在两种结构之间未发现功能相似性。值得注意的是，在这五个预测结构中，BbPETaseAND的位置各不相同，并且都与BbPETaseCD之间没有直接相互作用（图 2A）。为了研究两个结构域之间的蛋白质-蛋白质相互作用，作者将BbPETaseAND和 BbPETaseCD蛋白质分别单独纯化后混合在一起进行了SEC实验。结果蛋白质混合物以大约 45kDa的分子量洗脱，与BbPETaseFull非常相似（图2C），表明BbPETaseAND和BbPETaseCD通过直接接触形成复杂的结构，这与AlphaFold 2预测的模型不同。于是作者提出BbPETaseAND和BbPETaseCD具有紧密的域-域接触，这有助于提高BbPETase的热稳定性。同时作者推断BbPETaseAND对酶在 PET 疏水表面的非特异性吸附具有负面影响。BbPETaseCD的球状整体折叠可能提供更好的 PET 底物可及性，而BbPETaseFull的整体构象略有不同，强结合的附加结构域可能会阻碍酶和PET底物之间的接触。

图2. BbPETaseAND和BbPETaseCD之间的亲密接触。(A) BbPETaseFull的预测结构。五个预测模型显示为卡通图，并以不同颜色的附加N端域 (AND) 进行区分。(B) BbPETaseAND的预测结构。该结构以卡通图的形式显示。(C) BbPETase结构的SEC分析。通过SEC分析 BbPETaseAND、BbPETaseCD和BbPETaseAND/BbPETaseCD蛋白质混合物。(D) BbPETaseAND和 BbPETaseCD的下拉测定。为了确定BbPETaseAND和BbPETaseCD之间假定的结合界面，作者使用Hawkdock和 swarmdock服务器对蛋白质-蛋白质复合物进行了灵活建模。在450个预测模型中选择了7个假定模型，它们的BbPETaseAND的C端和BbPETaseCD的N端之间的距离适当。之后选择了15个残基，包括Ala99、Ser102、Thr169、Ser174、Thr184、Ser252、Thr255、Asn262、Asn282、Ser322、Ser325、Asn350、Ser354、Thr397和Ala406，并将这些残基替换为精氨酸（一种体积庞大且带正电荷的残基），以破坏BbPETaseAND和BbPETaseCD之间的接触。在选定的15个残基中，成功生产了8个变体，包括BbPETaseA99R、BbPETaseT169R、BbPETaseS174R、BbPETaseS252R、BbPETaseS322R、BbPETaseS325R、BbPETaseS354R和BbPETaseT397R。在进行SEC分析时，BbPETaseS252R、BbPETaseS322R、BbPETaseS325R和BbPETaseS354R 变体主要以与BbPETaseFull相似的保留时间洗脱（图3A）。BbPETaseA99R、BbPETaseT169R、BbPETaseS174R和BbPETaseT397R变体与BbPETaseFull的洗脱时间略有不同（图3A）。根据结果作者推测BbPETaseAND在Ala99、Thr169、Ser174和T397残基所在的区域与BbPETaseCD有密切接触。

图3. BbPETaseAND与BbPETaseCD结合界面的识别。(A) BbPETaseFull变体的SEC分析。(B) BbPETaseFull变体在30°C下使用mcPET作为底物的PET 降解活性。(C) BbPETaseAND和BbPETaseCD的假定结合模式。BbPETaseCD的结构显示为表面模型，催化三联体和可能位于结合界面的残基分别用橙色和洋红色表示并标记。AND的结构用青色卡通图显示。为了研究上述突变对PET降解的影响，作者使用mcPET在30°C下测量了变体的PET水解活性。在SEC实验中表现出与BbPETaseWT相似行为的四种变体BbPETaseS252R、BbPETaseS322R、BbPETaseS325 和BbPETaseS354R表现出与BbPETaseWT几乎相似的酶活性（图3B）。另一方面，在SEC实验中表现出不同行为的BbPETaseA99R、BbPETaseS174R和BbPETaseT397R 变体表现出增加的活性（图3B）。考虑到先前观察到BbPETaseCD表现出比BbPETaseFull更高的活性（图1DE），作者推测这三种变体的活性增加是由于BbPETaseAND和BbPETaseCD之间紧密相互作用的破坏引起的。最后作者给出结论， BbPETaseAND和BbPETaseCD之间的结合界面涉及Ala99、Thr169、Ser174和T397残基。在四个残基中，Thr169、Ser174和Thr397 残基位于BbPETaseCD结构中活性位点的右侧， BbPETaseAND可能通过含有Ala99残基的β7与该区域结合（图3C）。二、结论由于使用塑料的历史只有70年，降解塑料的微生物或酶的进化时间有限。虽然已经在自然界中鉴定出几种PET水解酶，但这些酶由于其低PET降解活性和稳定性差，限制了其工业用途。据报道，可以通过人工实验室进化这些酶来开发高效PET水解酶（Joo et al.，2018；Austin et al.，2018；Son et al.，2019，2020；Cui et al.，2021；Meng et al.，2021；Silva et al.，2011；Kawabata et al.，2017；Then et al.，2015；Tournier et al.，2020）。此外，正在开展发现和分析新型PET降解酶的研究（Sagong et al.，2021；Bollinger et al.，2020），这对于酶的进一步进化以及详细了解PET分解机制至关重要。