低pH插入肽-蛋白酶激活受体1复合物抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的实验研究

摘要  目的：观察低pH插入肽-蛋白酶激活受体1（pHLIP‑P1AP）复合物对三阴性乳腺癌（TNBC）MDA-MB-231细胞增殖的影响。

方法：设计、合成荧光标记的pHLIP‑P1AP。观察MDA-MB-231细胞与MCF-10A细胞表面蛋白酶激活受体1（PAR1）的表达情况。分析不同pH值（7.4、6.0）条件下荧光标记的pHLIP‑P1AP与MDA-MB-231细胞的结合情况及其对MDA-MB-231细胞增殖的影响。

结果：成功合成了pHLIP‑P1AP并进行荧光标记。在酸性环境下（pH 6.0），荧光标记的pHLIP‑P1AP与表面高表达PAR1的MDA-MB-231细胞有较强的结合能力，可明显抑制MDA-MB-231细胞的增殖，pHLIP‑P1AP为0.5 μg、1 μg、2 μg、4 μg、8 μg时，细胞的增殖抑制率分别为3.39%，5.27%，14.29%，22.14%、35.69%。

结论：MDA-MB-231细胞表面表达大量的PAR1。pHLIP‑P1AP在酸性环境下能够有效靶向MDA-MB-231细胞，并抑制MDA-MB-231细胞的生长，有望成为治疗TNBC的有价值的新型药物。

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer， TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor， ER）、孕激素受体（progesterone receptor， PR）和表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2， HER-2）均为阴性的乳腺癌，在所有乳腺癌患者中占15%~20%。TNBC具有侵袭性强、进展快和预后差等临床特点，乳腺癌治疗常用的内分泌治疗和靶向治疗对TNBC无效，因此，迫切需要针对TNBC开发新的治疗药物，以改进治疗策略［1］。

蛋白酶激活受体1（protease-activated receptor 1， PAR1）参与多种肿瘤的侵袭和转移过程，包括TNBC，是治疗肿瘤的潜在靶点［2］。Pepducin PZ-128是棕榈酰化的肽，由脂质部分和PAR1同源蛋白片段P1AP组成。有研究显示，PZ-128能够通过靶向PAR1的第三细胞内环抑制肿瘤细胞中的PAR1/G蛋白信号转导［2］。但PZ-128对肿瘤细胞不具有选择性，也可与人体正常细胞结合，因此PZ-128的不良反应较大、药理活性较弱。若能寻找一种新的载体将P1AP运送至肿瘤细胞内，可大大提高P1AP靶向治疗肿瘤的作用。

低pH插入肽［pH（low）insertion peptide， pHLIP］家族来源于细菌视紫红质C-螺旋，是一类可以靶向酸性肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）的新型载体［3-4］，靶向的分子机制是基于pHLIP在pH值较低的TME中插入肿瘤细胞膜并形成pH依赖性跨膜α-螺旋［5］。pHLIP将其C末端穿过细胞膜插入肿瘤细胞内，标记其C末端能够达到将治疗性分子运送到肿瘤细胞内的目的，并避免耐药，使P1AP高效积聚于肿瘤细胞内，达到更佳的治疗效果。

在本研究中，我们设计将pHLIP的C端与P1AP的N端通过二硫键连接起来，得到pHLIP‑P1AP复合物。通过实验验证pHLIP是否能够将其C端连接的P1AP运送至TNBC细胞株MDA-MB-231内，并通过靶向PAR1的细胞内环抑制PAR1/G蛋白信号转导，探讨其对TNBC的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 材料

PAR1兔单克隆抗体（Affinity Biosciences，江苏常州）；Cy3标记山羊抗兔IgG（江苏康为世纪生物科技有限公司，江苏泰州）；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（南京凯基生物科技发展有限公司，江苏南京）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）［西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，上海］。

1.2 （FITC）pHLIP‑P1AP的设计、合成及纯化

通过固相多肽合成法分别合成pHLIP（Var7）Cys与CysP1AP序列。pHLIP（Var7）Cys：AEEQNPWARYLEWLFPTETLLLELC；CysP1AP：CKKSRALF。将pHLIP（Var7）Cys与CysP1AP通过二硫键连接，得到pHLIP‑ P1AP序列，在pHLIP‑P1AP的N端标记异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate， FITC），C端进行酰胺化修饰，最终得到（FITC）pHLIP‑P1AP：（FITC）AEEQNPWARYLEWLFPTETLLLELC-CKKSRALF。将多肽通过反相高效液相色谱（reversed phase high performance liquid chromatography， RP-HPLC）纯化（Gemini NX 10 μ C18 100A，4.6 mm×250 mm，流速1.0 mL·min-1），测定其纯度，并采用电喷雾电离质谱法（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS）进行质谱分析。

1.3 细胞培养及细胞表面PAR1表达情况

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和人正常乳腺细胞MCF-10A购自中国科学院细胞研究所。MDA-MB-231细胞培养条件：用含10%小牛血清的L-15培养基，于37 ℃、无CO2条件下培养。MCF-10A细胞培养条件：DMEM/F12（1∶1）培养基+马血清（5%）+胰岛素（10 μg·mL-1）+表皮生长因子（20 ng·mL-1）+霍乱毒素（100 ng·mL-1）+氢化可的松（0.5 μg·mL-1），在37 ℃，5% CO2条件下培养。

在培养板中将达到细胞饱和密度的培养皿用PBS浸洗3次；用4%多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培养皿3次；0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透20 min。PBS浸洗培养皿3次；在培养皿内滴加5% BSA，37 ℃封闭30 min。用移液枪吸掉封闭液，在培养皿内滴加足够量稀释好的PAR1兔单克隆抗体（1∶200），37 ℃孵育3 h；PBS浸洗培养皿3次，滴加稀释好的荧光Cy3标记山羊抗兔IgG（1∶200），37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培养皿3次。滴加DAPI避光孵育5 min，对标本进行染核，用PBS冲洗多余的DAPI；用50%甘油封闭培养皿，然后在荧光显微镜（OLYMPUS）下观察并采集图像。

1.4 (FITC)pHLIP‑P1AP与MDA-MB-231细胞结合分析

将MDA-MB-231细胞以5.0×104个/孔接种在24孔板中。细胞附着于平板后，除去培养基，用磷酸盐缓冲液（25 mmol·L-1， pH 7.4）洗涤细胞。将细胞分为两组，将pH值为7.4、6.0的pH特异性L-15培养基分别加入孔中，置于37 ℃、无CO2环境下孵育过夜。向每孔中加入30 μL 100 nmol·L-1的（FITC）pHLIP‑P1AP，然后将24孔板置于培养箱内的摇动混合器中2 h。用相应的pH值（7.4、6.0）特异性磷酸盐缓冲液（25 mmol·L-1）洗涤所有细胞5次以除去任何未结合的探针，然后进行细胞荧光显像。

1.5 抗增殖实验

将MDA-MB-231人乳腺癌细胞以5.0×104个/孔接种在24孔板中。细胞附着于平板后，除去培养基，用磷酸盐缓冲液（25 mmol·L-1， pH 7.4）洗涤细胞。将pH值为7.4、6.0的L-15培养基分别加入孔中，置于37 ℃、无CO2环境下孵育过夜。将不同量的pHLIP‑P1AP（0 μg、0.5 μg、1 μg、2 μg、4 μg、8 μg）分别加入孔中，然后将24孔板置于培养箱内培养72 h。用相应的pH值（7.4、6.0）特异性磷酸盐缓冲液（25 mmol·L-1）洗涤所有细胞5次以除去任何未结合的探针。使用比色MTT测定法测定细胞活力，将20 μL 5 mg·mL-1 MTT溶液加入细胞中，37 ℃孵育4 h。将所得的晶体溶解于150 μL DMSO中，并使用酶标仪在490 nm处测量吸光度，计算细胞增殖抑制率。

1.6 统计学分析

采用SPSS 24.0.0.0（IBM）统计学软件进行数据处理。变量以均数±标准差（x¯±s）表示。采用one-way ANOVA进行变量的比较，P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 (FITC)pHLIP‑P1AP的合成及纯化

成功合成（FITC）pHLIP‑P1AP，简言之，pHLIP（Var7）Cys和CysP1AP通过固相多肽合成法合成，通过氧化反应使两条肽之间形成二硫键，得到pHLIP‑P1AP，在pHLIP‑P1AP的N端标记FITC，得到（FITC）pHLIP‑P1AP。（FITC）pHLIP‑ P1AP的RP-HPLC分析显示有1个主峰（96.877 7%， 11.193 min）和2个较小的杂质峰（图1A）；ESI-MS分析显示3个质谱峰，m/z分别为753.8（［m+6H］6+）、904.3（［m+5H］5+）、1 130.2（［m+4H］4+）（图1B）。实测分子量（4 516.8、4 516.5）与理论分子量（4 517.17）基本相符。

2.2 MDA-MB-231和MCF-10A细胞表面PAR1表达

MDA-MB-231细胞高表达PAR1，而MCF-10A细胞中PAR1表达水平较低（图2）。半定量分析显示，MDA-MB-231细胞相对荧光强度/细胞为（100.00±3.53）%，MCF-10A细胞的相对荧光强度/细胞为（39.04±5.70）%，前者明显高于后者，差异有统计学意义（F=254.629， P<0.01）。

2.3 (FITC)pHLIP‑P1AP与MDA-MB-231细胞结合分析

在酸性pH下（pH 6.0），探针与MDA-MB-231细胞有较高的结合能力；在pH 7.4时，探针与MDA-MB-231细胞仅有轻微的结合（图3）。

2.4 抗增殖实验

与pH 7.4时相比，pH 6.0时pHLIP‑P1AP可明显抑制MDA-MB-231细胞增殖（P<0.05）（图4）。在pH 6.0，探针剂量为0.5 μg、1 μg、2 μg、4 μg、8 μg时，MDA-MB-231细胞增殖抑制率分别为：（3.39±0.7）%、（5.27±1.1）%、（14.29±0.1）%、（22.14±1.2）%、（35.69±1.2）%。

3 讨论

TNBC发病年龄较小，早期易发生转移，因缺乏相应的受体导致常规治疗无效，已成为乳腺癌治疗领域的难点和研究热点［1］。PAR1是一种G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor， GPCR），存在于多种肿瘤细胞表面，是肿瘤的潜在治疗靶点［2］。本研究通过免疫组化证实TNBC MDA-MB-231细胞表面存在大量PAR1，而正常人乳腺细胞MCF-10A细胞表面基本未见PAR1表达，因此，PAR1有望成为TNBC诊断、治疗的潜在靶点。

PAR1抑制剂PZ-128是一类脂化肽，能够进入细胞内并抑制PAR1/G蛋白信号转导［2］。PZ-128目前处于Ⅱ期临床试验阶段，正在开发其通过靶向血小板表面PAR1抑制血小板功能的作用，对于急性冠状动脉综合征（acute coronary syndromes， ACS）患者和接受冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention， PCI）患者的有效治疗至关重要［6］。另外有研究证实，PZ-128可以抑制乳腺癌、肺癌、卵巢癌的生长和转移［7］。PZ-128与GPCR确切的作用机制仍不清楚，但有研究者提出，肽可以直接与其同源受体相互作用，使受体处于活性或非活性构象［8］。PZ-128并不能特异性靶向肿瘤细胞，如果能利用特异性靶向肿瘤的载体代替棕榈酸，将P1AP运送至肿瘤细胞内，则可以最大程度避免探针进入正常细胞内从而减少不良反应的发生。

TME的特征是呈酸性［9-10］。几乎所有实体肿瘤细胞内pH为中性或碱性，而细胞外pH为酸性，可低至6.0［11-13］。TME呈酸性的机制包括缺氧引起的无氧糖酵解、有氧糖酵解（Warburg效应）、失控的细胞生长导致的CO2产生增加，以及细胞膜上离子泵活性增加［9， 11］。酸性TME具有稳定性，不受肿瘤克隆选择的影响，因此也被认为是有前景的肿瘤靶向检测标志物［3， 5］。研究显示，pHLIP家族肽能够靶向TME，该肽来源于细菌视紫红质C-螺旋，最初被称为BRC肽［14］。pHLIP能够感应细胞膜附近的pH值，当细胞外环境呈酸性时可自发插入细胞膜中并形成螺旋结构［15］。pHLIP的最大优势之一是能够将极性和中度疏水的分子直接运送到细胞内，避免了因细胞内吞产生的耐药性。许多研究表明，pHLIP可以连接多种不同的分子，如荧光染料、毒素、药物、肽和肽核酸等［16-23］。pHLIP变体中有4条序列具有较高的肿瘤靶向性：野生型（WT）、变体3（Var3）、变体7（Var7）及ATRAM［24］。有研究通过一种不可切割连接子（chloro-acetylchloride）将pHLIP（WT）与P1AP肽连接起来，得到pHLIP（WT）-P1AP，可以抑制高表达PAR1受体的人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7的生长［21］。我们在此研究的基础上做了一些改动：（1）本研究选用的载体是pHLIP家族Var7序列。pHLIP（Var7）是靶向肿瘤的pHLIP家族中最短、极性最强的肽序，具有容易合成、血液清除快等优点，最初应用于靶向GPCR的研究。血液清除快能够提高显像剂的靶/非靶比值，提高显像质量，这一特点提示pHLIP（Var7）也有成为显像剂的潜力（如通过荧光标记、放射性核素标记等），从而兼顾肿瘤的显像与治疗。（2）利用二硫键代替chloro-acetylchloride连接pHLIP（Var7）与P1AP肽，二硫键可在细胞内裂解，从而将P1AP送至细胞内，该方法简化了pHLIP-P1AP的合成，有利于推广。

本研究细胞结合实验显示，（FITC）pHLIP-P1AP与MDA-MB-231细胞在酸性环境下（pH 6.0）有较高的结合能力，在pH 7.4时基本上没有结合，提示pHLIP可以靶向酸性组织，与既往关于pHLIP的研究结果一致。抗增殖试验显示，pH为6.0时，pHLIP-P1AP可以显著抑制MDA-MB-231细胞的生长，提示在酸性条件下pHLIP可以有效地将P1AP运送至MDA-MB-231细胞内，二硫键裂解并释放P1AP，通过抑制PAR1/G蛋白信号转导起到细胞毒性作用。

本研究在前人的研究基础上设计合成了可抑制MDA-MB-231细胞生长的新型治疗性分子pHLIP-P1AP，从细胞水平证实pHLIP-P1AP能够靶向MDA-MB-231细胞并有效抑制其生长，但能否抑制TNBC实体肿瘤的生长尚不清楚。由于条件限制，本研究没有进行动物水平的治疗性研究，在条件允许时将会进行后续研究，也希望其他的研究者能够对本研究进行补充。

4 结论

目前，TNBC缺乏有效的临床治疗手段，患者预后较差。新型靶点的开发对TNBC未来的治疗策略具有重要意义。MDA-MB-231细胞表面表达大量PAR1，可以将PAR1作为其治疗靶点。pHLIP-P1AP在酸性环境下能够有效靶向MDA-MB-231细胞，并通过抑制PAR1/G蛋白信号转导抑制MDA-MB-231细胞的生长，有望成为治疗TNBC有价值的新型药物。

免责声明：本文为行业交流学习，版权归原作者所有，如有侵权，可删除