肽功能化纳米粒在肿瘤精准诊疗中的研究进展

摘要：随着纳米粒表征技术及纳米粒表面修饰功能化技术的不断完善和发展，目前已可在纳米粒表面进行肽特殊功能化处理，实现肽修饰纳米粒的多功能化用于肿瘤成像和治疗。本文拟对肽配体功能化的制备方法、肽功能化纳米粒的主要性能以及在肿瘤精准诊疗中的应用作一综述。

近年来，作为药物输送工具、高对比度显像剂或化学治疗剂的纳米粒为肿瘤的诊疗以及其他生物医学技术提供了新的机会。未经功能化的纳米粒通常能够在受控的体外环境下实现其所需功能。但是，其在人体更复杂的环境中使用时，仍然存在许多问题。例如：由于肿瘤的血管和间质屏障作用以及肿瘤细胞暴露于氧浓度、营养成分非均匀分布的环境，纳米粒介导的药物递送系统是否能使药物到达整个肿瘤组织；此外，随着化疗药物的使用，越来越多的癌症患者产生耐药性，最终死于肿瘤转移或复发。有研究发现，一系列具有肿瘤靶向性的多肽或蛋白质修饰的载药纳米粒（如脂质体、聚醚、胶束和纳米凝胶）可达到精准靶向肿瘤组织的目的。同时，制备具有多功能的多肽或蛋白质可提高肿瘤诊疗敏感性、抵抗肿瘤耐药性。本文将对目前肽功能化纳米粒的制备方法、主要性能及在肿瘤精准诊疗中的应用作一综述。

1 肽配体功能化的常见制备方法

1.1 固相肽合成法

自1963年Merrifield成功发明固相多肽合成方法以来，已经有多种自定义合成肽用于制备肿瘤药物、荧光或放射物标记肽等。在Smilowicz的线性肽LTVSPWY及两个具有肿瘤细胞毒性的环状DfKRG和KTTHWGFTLG靶向肽联合金属环化金纳米粒对乳腺癌进行治疗的实验中，这3种肽均是采用Fmoc固相肽合成法合成［1］。例如，在线性肽LTVSPWY的合成中，首先将酪氨酸（Y）的α氨基用Fmoc保护，羧基端与HO-wang固体树脂相连后脱去Fmoc保护基［2］，继而结合Fmoc保护的色氨酸（W），重复此3项操作（图1），所得线性肽链LTVSPWY使用高效液相色谱法纯化。同理可获得环状肽DfKRG和KTTHWGFTLG。这种以合成特定氨基酸序列为基础的肽合成法，能大大降低每步产品提纯的难度，避免了中间产物的流失，是最常见的功能化肽基础制备法之一。

1.2 化学反应

除此以外，在现有肽库中，多肽之间也可通过简单的化学反应产生具备功能化的化学键或官能团。Kiran等［3］采用固相肽合成法合成了二苯丙氨酸肽（FF），并使用聚戊二醛nGA的醛基（—CHO）与FF的氨基（—NH2）发生席夫碱反应，生成具有pH敏感性的C=N双键，该产物可通过π-π堆叠自组装成类磷脂壳结构的纳米粒，同时使用肿瘤靶向性的叶酸（folic acid， FA）与该纳米粒外壳基团（—COOH）通过固相肽合成法进行修饰，合成FA-FF-NPs（图2），使该纳米粒具有pH响应性的同时，在受体介导的内吞作用后增强化疗药物的细胞内释放。这种通过简单的化学共轭反应将二肽基序连接并进行自组装的方法，减少了代谢产物，提高了纳米粒的物理稳定性以及药物包封率，同时也可增强纳米粒的靶向治疗效果。

1.3 其他方式

除以上两种方法外，还有其他特殊合成方法使肽具备多功能化。Feng等［4］将肿瘤细胞归巢肽CVNHPAFAC和肿瘤血管内皮生长因子受体2的靶向肽K237通过一种特殊的GYG接头连接，修饰载紫杉醇的聚乳酸（polylatic acid，PLA）纳米粒，以增强多靶点治疗胶质母细胞瘤的疗效。Santi等［5］采用迭代多尺度建模方法，并结合定量构效关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）分析和进化算法，设计了一种转铁蛋白结合肽，它能够在不涉及与转铁蛋白受体（transferrin receptor， TfR）或铁结合的基础上结合转铁蛋白。将转铁蛋白结合肽CGGGHKYLRW（TBP-Ps）与对二硫交联聚合物纳米粒进行自组装式修饰，可在体外介导靶向传递至TfR过表达的HCT-116结直肠癌细胞［6］。

2 肽功能化纳米粒的性能及其应用

2.1 有效靶向特异性

近年来，噬菌体肽库展示技术大大提高了筛选可特异识别肿瘤表达受体的肽配体的能力。在肽配体中，从内源性蛋白质序列中获得的多肽相对安全且免疫原性低，并且多肽具有结构简单、药动学和组织分布良好、易于化学合成、成本低廉等优点。多项研究表明，将能靶向肿瘤受体的多肽连接到纳米粒表面，同时将肿瘤治疗药物或成像剂包载入纳米粒，使纳米粒在精准靶向肿瘤细胞或组织的同时发挥其诊疗一体化作用。表1概述了部分肽配体用于精准靶向肿瘤的纳米粒。

2.2 肿瘤微环境响应性

由于肿瘤细胞的异常生长代谢和肿瘤细胞与肿瘤间质细胞、周围上皮细胞、细胞外基质之间的相互作用，肿瘤中存在多种独特的物理化学微环境，包括低酸碱度、缺氧、高水平谷胱甘肽（glutathione， GSH）和过氧化氢（H2O2）以及过表达的酶和蛋白质等，这些独特的微环境通常有益于肿瘤增殖、侵袭、黏附。正是因为这种独特的微环境，它们才被视为肿瘤特异性纳米粒的内源性刺激。肽配体除了能特异性靶向肿瘤组织或细胞表面受体外，还可在不改变其基础靶向功能的前提下对其进行修饰，使配体肽具备肿瘤微环境响应功能，最终使这些肽功能化纳米粒在正常组织中处于“闭合”状态，但在被肿瘤细胞摄取时变为“开启”状态，从而提供较高的治疗敏感性和选择性以及较低的副作用。

2.2.1 pH响应性

在肿瘤组织中，由于肿瘤细胞的生长速度通常比正常细胞快，现有的营养物质和血氧含量不能满足其生长需求。不同于正常细胞的氧化磷酸化，肿瘤细胞通过厌氧糖酵解产生生存所需能量。通过这种新陈代谢方式，肿瘤细胞将产生大量乳酸和三磷酸腺苷水解产物，以及一些过量的二氧化碳和质子，这可导致肿瘤部位的酸性增加，并且pH值低于正常组织。通常，正常人体组织和细胞溶酶体的pH值分别为7.4和5.0~6.5，而肿瘤组织和肿瘤细胞溶酶体的pH值分别为6.0~7.0和4.0~5.0。为了探索这种特殊的酸性微环境以改善肿瘤的诊断和治疗，有研究成功合成了由RGD衍生物RGDSEEEEEEEEEEK作为pH敏感段、硬脂酸作为疏水段、并负载阿霉素的肽两亲胶束（RGDS-E10-Lys）。其可以在中性介质中形成均匀分散的纳米粒，但在酸性介质中崩解并释放阿霉素，以达到治疗宫颈癌的目的［22］。

在此基础上，肿瘤独特的酸性环境还可以刺激pH响应型肽以反转纳米粒表面电荷，促进细胞的安全传递和内化。Jiang等［23］发现，用2，3-二甲基马来酸酐（2，3-Dimethylmaleic anhydride， DMA）修饰肽D［KLAKLAK］2（KLA）后与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine， DSPE）结合，得到DSPE-KLA-DMA（DKD，K肽）脂质以制备脂质体。在人耐药性肺癌A549/Taxol细胞的pH值（约6.8）下，该脂质体可以逆转其表面电荷（从负到正），从而促进细胞摄取。同时，KLA肽能引导脂质体选择性聚集到线粒体中，并有利于将紫杉醇释放到所需部位，促进该多药耐药性肿瘤细胞的凋亡。

除此之外，有研究将两种肽修饰于纳米粒以达到“1+1>2”的目的。Wan等［24］将两个分离的肽CREKA（肿瘤归巢肽）和F3（细胞穿膜肽）通过pH敏感的腙键（—NH—N=）结合在一起，并使用聚乳酸的纳米平台用于三阴性乳腺癌的药物递送。实验结果证明，这种方式不仅能准确地进行药物递送，而且独特的酸性环境可破坏表面的腙键，使得F3肽的非特异肿瘤血管内皮细胞靶向穿透性得以解封，显著降低了位点效应，同时双肽纳米粒比单肽纳米粒更能提高药物的内在渗透效应。

2.2.2 GSH响应性

由于肿瘤细胞内部与外部环境的生长潜力不同，肿瘤细胞会过量产生某些还原性物质。GSH是一种典型的肿瘤细胞过表达还原物质。通常，肿瘤细胞质中GSH的浓度可以达到2~10 mmol·L-1，比细胞外液和血液高100~1 000倍。因此，GSH已被认为是设计肿瘤特异性智能纳米药物的理想刺激元素。对于GSH反应性有机分子探针或纳米探针的设计，以下几个可还原键，包括二硫键、硒键和硝基偶氮芳基醚，引起了研究者极大的关注。在GSH的存在下，这些可还原的键可以被切割，从而导致探针的活化。例如，Yuan等［25］报道了一种GSH活化的近红外（near infrared， NIR）荧光探针CyA-cRGD，该探针由结合荧光猝灭单元（硝基偶氮芳基醚基）的NIR荧光单元CyA和肿瘤靶向单元的cRGD组成。在存在GSH的情况下，连接荧光猝灭单元和荧光单元的硝基偶氮芳基醚基团将被裂解，形成荧光单元成像。对照实验表明，该GSH响应性的CyA-cRGD探针对其他不同的氨基酸和金属离子无响应性。该探针还具有出色的肿瘤靶向能力，显示出高荧光信噪比，可区分肿瘤组织和正常组织。此外，Zhao等［26］将特定的肽序列Arg-Val-Arg-Arg（RVRR）通过氟化作用合成具有放射性的示踪剂乙酰基-RVRR-Cys-Gly-CBT，该示踪剂在弗林蛋白酶和GSH的激活下发生分子间环化反应形成二聚体，然后自组装成纳米粒，在正电子发射断层扫描成像中显示出良好的肿瘤摄取效果以及成像效果。这也使得GSH响应性纳米探针在不同模态方式下精准成像诊断成为可能。

2.2.3 肿瘤细胞毒性

目前，传统的包载化学药物的纳米粒已使一部分肿瘤组织产生对化学疗法和放射疗法的耐药性，严重影响了肿瘤治疗的效果。因此，有研究对细胞穿膜肽侧链进行修饰，使其具有特异性和靶向性的同时对肿瘤细胞或组织产生毒性，以期望使用低剂量治疗药物达到特异性杀伤耐药性肿瘤细胞的目的。2017年，有研究发现拮抗剂G（AG）是一种合成的神经肽拮抗剂，可阻断促胃液素释放肽、加压素、缓激肽和内皮素等多种神经肽，从而对小细胞肺癌生长产生抑制作用，并且具有靶向结合G蛋白偶联受体的能力［27］。2020年，Huang等［28］将AG肽和细胞穿透肽TAT（GRKKRRQRRR）用于修饰包载有抗癌药物ETP和siPIK3CA的聚乙二醇化聚乳酸-羟基乙酸［poly（lactide-co-glycolide）-poly（ethylene glycol）， PLGA-PEG］纳米粒，以治疗CD133（+）的耐药性小细胞肺癌。

此外，研究发现还有其他能影响肿瘤细胞活性的细胞穿膜肽，比如细胞穿膜肽T7含有与肿瘤抑素相关的整个抗血管生成活性片段，已被证实在肝细胞癌等肿瘤细胞中具有潜在抗肿瘤作用［29］；mitoparan衍生物Z-Gly-RGD（DPhe）-mitP能触发caspase依赖的肿瘤细胞凋亡［30］。这些具有肿瘤细胞毒性的功能化靶向肽或肽的类似物或许都可修饰到纳米粒表面以增强抗肿瘤效果，期望为解决肿瘤耐药性提供更多可能。

3 结论和前景

目前，各种肽功能化的纳米粒材料（如脂质体、PLGA、金属、磁铁矿、金刚石纳米粒）已被合成并应用于联合增强肿瘤成像与治疗的研究中。大量研究结果表明，虽然肽功能化合成步骤中增加的结构复杂性使纳米粒通常可以获得更强的识别性，但可能是以降低生物稳定性和网状内皮系统的识别性为代价，使其在体内复杂的环境中迅速丧失活性。此外，许多肽功能化纳米平台系统依赖于无机核，由于它们具有相关毒性，因此减少金属成分的浸出至关重要。总之，未来肽功能化纳米粒用于肿瘤诊疗的发展大概包括以下几个方向：探索肽配体的新性能，发现有可能呈现出的新性质和功能；研究新的制备方法，包括对传统方法的改造，多种方法的结合使用，与其他新技术如生物、激光技术的结合等；提高纳米粒在体内的有效性、可控性、稳定性。期望肽功能化纳米粒的应用能在肿瘤精准靶向诊疗中实现更大的突破。

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