免疫沉淀（姊妹篇）：常见问题&解决方案

免疫沉淀技术可以与基因组技术、放射同位素技术、聚合酶链式反应、免疫印迹等实验方法相结合，对较复杂的蛋白质与DNA/RNA的关系和定位提供非常好的解决方法。先了解这几种方法的区别：

种类	研究对象	结合技术
染色质免疫沉淀 (CHIP)	DNA-蛋白质	PCR
蛋白质免疫沉淀 (PIP)	抗原-抗体	蛋白免疫印迹
放射免疫沉淀 (RIP)	抗原-抗体	放射性同位素技术

当然，再结合其他技术还可以衍生出更多的技术，本篇先来剖析一下染色质免疫沉淀（CHIP）。

CHIP

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。其原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。后期通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用：ChIP可以用来检测体内反式作用因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP与其他方法的结合扩大了其应用范围：ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的体内结合位点；RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

操作也可以很简单

1

甲醛处理细胞

2

收集细胞，超声破碎

3

加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合

4

加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，沉淀

5

对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合

6

洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物

7

解交联，纯化富集的DNA-片断

8

PCR或基因芯片分析

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翘首以待实验成果

然后有人欢喜有人忧

怎么把“惊吓”变成“惊喜”

this is a question

只要找到破解方法，

所有的问题都不是问题！

今天我们就来一一击破

免疫沉淀系列实验中那些揪心的问题。

1 WB结果背景高且不均匀

原因	方案
洗涤不充分	离心前盖上管盖反复颠倒几次
抗体浓度太高	检查推荐抗体用量，尝试使用更少的抗体
抗体特异性不够	使用亲和纯化的抗体，最好预先吸收
封闭不充分	优化封闭时间/温度，室温封闭1小时或4℃封闭过夜
封闭液中与其他蛋白发生抗体的交叉反应	换一种不同的封闭液；不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭，牛奶含生物素
操作设备被污染	保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁，无外源污染物

2 WB结果信号弱或无信号

原因	方案
蛋白未转到膜上	可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流
一抗、二抗等不匹配	选择针对一抗来源的种属抗体
过度封闭	使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液；试用不同的封闭液；减少封闭时间
洗膜过度	洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20
曝光时间太短	延长胶片的曝光时间，超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时

3 杂带较多/特异性条带异常

原因	方案
细胞传代次数过多，蛋白表达模式分化	使用原始或传代少的细胞株或进行平行实验
样本处理过程中目的蛋白发生降解	使用新鲜制备的标本并使用蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作
一抗不纯	使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特异条带
一抗特异性不高	重新选择或制备高特异性的抗体

如果你的WB实验出现了这些问题，

这些方案供你参考，

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问题多，方法更多。

小编更希望你们实验开挂，这些问题统统木有！