体外脑细胞在培养皿中“打游戏”
今年 9 月,Neuron 发表了这样一项有趣的研究:体外神经元在模拟游戏世界中能够学习并表现出感知能力。在这项研究中,Kagan 和他的团队开发了 DishBrain 系统 (一种在结构化环境中能利用神经元固有的自适应计算能力的系统)。研究者们将 hiPSC 或 E15.5 小鼠胚胎的原代皮层细胞中提取的神经元电镀到高密度多电极阵列 (HD-MEAs) 芯片上,并通过 DishBrain 系统嵌入到类似街机游戏的 “Pong” 中。DishBrain 系统可以从神经培养中 “读取” 信息 (记录神经元在培养中的电活动),又能将感官数据 “写入” 到神经培养中 (即给神经元提供非侵入性的 “感觉” 电刺激)。并通过改变感官信息的模式,创造了不同的 “DishBrain” 环境,使神经元做出不同的响应 (类似于神经元网络中活动产生的动作电位)。
图 1. DishBrain 系统和实验方案示意图[1]
研究结果表明,在这个 DishBrain 系统,人类和小鼠的神经元在一个碟子里学会了玩电子游戏 “Pong” 。皮质神经元可以自我组织活动,在模拟游戏世界中显示智力和有 “感觉” 的行为,并随着时间的推移改变它们的行为。这项研究在扩展当前对大脑如何工作、智力如何产生的理解方面具有重要意义。
图 2. DishBrain 中的神经细胞阵列正在工作[2]
不同颜色标志着不同类型的神经细胞及其组成成分。图片来源:皮质实验室
对于 “脑” 的研究,前进的脚步从未停止,上述研究让 #首次证明人脑细胞在体外也有智力#、#人脑细胞在培养皿中打游戏# 等词条一度火上微博热搜。
就在前几天,Nature 于 10 月 12 日在线发表的题为 Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids 的研究性文章,更是打开 “脑” 研究的新纪元。
“人鼠脑” 融合,脑疾病研究新途径
关于 “人鼠融合脑”
在这里,首先复习下什么是类器官:由原代组织、ESCs 或 iPSCs 衍生而来的体外 3D 细胞簇,它们具有自我更新和自组织能力,并表现出与起源组织相似的器官功能 (可戳前文:类器官——从 2D 到 3D 的进阶)。从多能干细胞生成层压的大脑皮层样结构,称为人类皮质球体 (hCSs)。hCSs 包含来自深层和浅表皮质层的神经元,这些神经元在电生理上成熟,能表现出自发活动,被非反应性星形胶质细胞包围并形成功能性突触。皮质神经元参与神经网络活动并产生复杂的突触事件[3]。
hCSs 在培养皿中 (体外) 大概长下面这样~
成功移植人类皮质球体 (hCS) 至鼠脑
这个研究中,作者团队将类器官 “玩” 出了新花样:首先将完整的体外 3D 人类皮层类器官 (human cortical organoids, hCO) 立体定向移植到出生后 3-7 天的早期无胸腺大鼠的 S1 区 (初级体感皮层 S1 区,特异性投射系统的高级神经中枢;该区域可以接收来自鼠感觉器官的信号,然后将它们传递到大脑区域) (图 4a),整合为 t-hCO (transplanted hCO)。移植后约 2 个月,在 81% 的移植动物中鉴定到了 t-hCO (n=72),并且有 87% 位于大脑皮层 (图 4b)。核磁共振成像 (MRI) 结果表明,t-hCO 在 3 个月内体积增加了 9 倍 (图 4d),并且移植后 12 个月,移植动物的存活率也很高 (74%)。
小 M 偷偷感叹:大制作啊,且不说技术牛轰轰,光是实验造模的时间都体现出了对科研的热爱~
a. 实验设计原理图。b. 移植2个月后 S1 区 t-hCO 的 MRI 图像。c. hiPS 细胞系移植成功率的量化。
d. 3 个月后的冠状位 MRI 图像。
t-hCO 的细胞结构和细胞组成
移植成功的 t-hCO 的细胞组成具体是什么呢?体内生长的 t-hCO 又与体外的 t-hCO 有何不同?
免疫染色结果显示 IBA1 的染色 (小胶质细胞) 充满整个移植物,此外 t-hCO 中不仅存在大鼠小胶质细胞 (图 5a),还存在皮质祖细胞、神经元、神经胶质细胞以及少突胶质祖细胞。研究者们还确定了 t-hCO 中主要表达皮质细胞类别的簇,包括深层和表层谷氨酸能神经元、循环祖细胞等细胞 (图 5b)。差异基因表达分析结果还发现 t-hCO 神经元成熟相关的基因组的上调 (例如突触信号传导、树突定位和电压门控通道活性) (图 5c)。
小知识:谷氨酸能神经元是一类能释放兴奋性递质谷氨酸 (Glutamate) 到突触间隙,产生兴奋性突触后电流的神经元。中枢神经系统中重要的兴奋性神经元。
研究者们还发现,t-hCO 神经元相当大,总树突长度比体外 hCO 增加六倍,树突棘密度也显著高于 hCO 神经元 (图 6a-b)。此外,t-hCO 的谷氨酸能神经元簇与成人 L2/3、L5 和 L6 神经元亚类重叠,例如,与体外 hCO 神经元相比,灵长类动物特异性活性调节基因 (BDNF18、SCG2 和 OSTN) 在 t-hCO 神经元中的表达增加,这表明 t-hCO 具有人类皮层神经元高级形态和功能特征。
t-hCO 适用于揭示人类疾病
既然 t-hCO 能够重现人类皮层神经元高级形态和功能特征的能力,那么 t-hCO 是否可用于揭示疾病表型? 以蒂莫西综合征 (Timothy Syndrome, TS) 为例,研究者们将 TS 患者和对照参与者的来源的 hCO,移植至大鼠 (图 7a),与对照相比,TS hCO 树突形态发生了改变,具有异常的树突分支模式 (图 7b),这种分支异常的模式,与作者团队以前关于 TS 疾病的研究结果一致。而且这种异常的分支模式,在类似分化阶段的体外 TS hCO 中没有表现出来 (图 7c)。由此可见,通过将人脑组织植入大鼠体内来揭示疾病表型,十分可行。
图 7. t-hCO 中的高级神经元特征揭示了人类皮层神经元中活动依赖性疾病表型[4] a. 将对照和 TS hiPS 细胞系产生的 hCO 移植到新生大鼠体内。b. 对照组和 TS 组 t-hCO 神经元的三维重建。c. hCO 和 t-hCO 中 TS 和对照神经元的 shell 分析。
t-hCO 在大鼠体内的成功融合
那么 t-hCO 细胞在多大程度上融入了大鼠 S1?以及 t-hCO 是否可以在活体环境下被感官刺激激活? 用改造的腺相关病毒 rabies-dG-GFP/AAV-G 感染 hCO,并移植到大鼠 S1 中。在移植后 7-14 天,可以在鼠脑观察到同侧 S1 和腹基底核神经元中密集的绿色荧光蛋白 (GFP) 表达 (图 8b-c)。为了评估在 t-hCO 细胞中是否可以引起突触反应,电流刺激大鼠 S1、内囊、白质、t-hCO 中附近的纤维,可诱发 t-hCO 神经元中的短潜伏期兴奋性突触后电流事件 (excitatory postsynaptic current events, EPSCs),且 AMPA 受体拮抗剂 NBQX 可将其阻断 (图 8f-g)。这表明 t-hCO 在解剖学上成功整合到大鼠大脑中,成为了它的一部分!
图 8. 移植的 hCO 接收与感觉相关的输入[4]
a. Rabies-tracing 实验示意图。b. t-hCO 和大鼠皮层之间的 GFP 和人 STEM121 表达。c. GFP 表达细胞的定量。d-e. t-hCO 中 Netrin G1+ 丘脑末端。f-g. 大鼠 S1 或者内囊电刺激后 t-hCO 神经元的电流痕迹。
t-hCO 激活大鼠神经元以驱动大鼠寻求奖励的行为
那么,t-hCO 是否可以在活体环境下被感官刺激激活?最最最惊险的部分来了!
为了研究了 t-hCO 是否可以激活大鼠的神经电路来驱动行为,研究者将表达 hChR2-EYFP 的 hCO 移植到 S1 中,将光纤植入 t-hCO 中进行光传输。然后,对大鼠进行改良的操作性条件反射范式训练 (图 9a)。将动物放入行为测试室并随机交错呈现蓝色和红色激光刺激。如果动物在蓝光刺激期间舔舐,动物会获得水奖励,但如果它们在红光刺激期间舔舐则不会。
在训练的第一天,无论是蓝光还是红光刺激,动物的舔舐行为都没有差异。然而,在第 15 天!大鼠学会了把蓝光刺激和喝水联系了起来。移植了表达 hChR2-EYFP 的 hCO 的动物在蓝光刺激期间表现出更多的舔舐。移植了表达对照荧光团的 hCO 的对照动物中未观察到这些舔行为的变化 (学习成功率:hChR2 89%,EYFP 0%,图 9b-e)。这表明植入的人脑类器官已经真正参与了大鼠大脑的工作,t-hCO 细胞可以激活大鼠神经元以驱动寻求奖励的行为。
图 9. 移植的 hCO 在大鼠神经元上
建立功能性连接并调节行为[4]
a. 行为任务的示意图。b. 实验动物在训练第 1/15 天的表现 (红蓝光试验累积舔舐次数)。c-d. 移植 t-hCO 表达 hChR2-EYFP 荧光团的的行为表现。e. 偏好评分的演化。
总结
这项研究建立了人脑类器官与实验动物连接的新模型,与单纯的体外培养或构造动物疾病模型相比相比,利用老鼠脑内环境培育的人类器官更能还原疾病环境、更贴合实际疾病的情况,这让后续模拟实验变得更准确,进而帮助人们研究与治疗自闭症等神经类疾病。
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参考文献
1. Brett J Kagan, Andy C Kitchen, Nhi T Tran, et al. In vitro neurons learn and exhibit sentience when embodied in a simulated game-world. Neuron. 2022 Sep 20; S0896-6273(22)00806-6.
2. Heidi Ledford. Neurons in a dish learn to play Pong — what’s next? Nature News. 12 October 2022.
3. Anca M Paşca,1,13 Steven A Sloan, Stephen J Smith, et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 2015 Jul;12(7):671-8.
4. Omer Revah, Felicity Gore, Kevin W Kelley, et al. Maturation and circuit integration of transplanted human cortical organoids. Nature. 2022 Oct;610(7931):319-326.
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