■ 黑色素合成与“晒黑”的经典途径
黑色素合成：黑色素合成发生在黑色素细胞中的黑素体中，可分为 2 个阶段
第一阶段：酪氨酸在酪氨酸酶的催化作用下生成 L-二羟基苯丙氨酸多巴 (L-DOPA)，并在酪氨酸酶作用下进一步生成多巴醌 (DQ)。
第二阶段：有半胱氨酸或谷胱甘肽 (Cys/GSH) 存在时，DQ 与其反应生成半胱氨酰多巴或谷胱甘肽多巴，进而被氧化聚合生成褐黑素 (可溶性聚合物，易代谢)；当它们不存在时，在酪氨酸酶或 TYRP1 等氧化酶的作用下，形成 DHI 和 DHICA 黑色素。这 2 种黑色素，不易代谢，俗称“真黑素”。
图 1. 黑色素合成途径与经典“晒黑途径”
a: 黑色素合成涉及酪氨酸酶基因家族中的 3 种酶，即酪氨酸酶 (TYR)、酪氨酸酶相关蛋白 1 (TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白 2 (TRP-2); b: cAMP-MITF-色素沉着途径
“晒黑”的经典途径：紫外线照射导致角质形成细胞中的 DNA 损伤和 p53 活化，p53 激活 POMC，POMC 前蛋白裂解形成的 α-MSH。α-MSH 与黑素细胞膜中的 MC1R 结合，导致 cAMP 增加和 PKA 激活。活性的 PKA 使小眼相关的转录因子 (MITF) 增加，MITF 转录进而调节色素沉着酶，如 TYRP1、TRP2 和酪氨酸酶等。
■ Cell 高分阐述皮肤色素沉着的新机制
在今年 7 月 6 日，Cell 在线发表了 “NNT mediates redox-dependent pigmentation via a UVB-and MITF-independent mechanism”。这篇文章阐述了一种皮肤色素沉着的新机制，参与调节这一过程的主要为烟酰胺核苷酸转氢酶 (NNT)，NNT 消耗调节细胞内氧化还原水平变化，影响酪氨酸酶降解，还参与调节真黑色素水平和色素沉着。
图 2. 研究思路
■ NNT 敲低导致黑色素含量增加
在黑色素瘤细胞系 UACC257 中，siRNA 敲低 NNT 表达会导致黑色素含量的增加 (图3a)。与此同时，siNNT 后色素沉着的增加被酪氨酸酶的敲低阻断 (图3b)，这表明 siNNT 介导的色素沉着对酪氨酸酶的依赖性。
由于 NNT 可以通过控制 NADPH 转化来调节线粒体氧化还原水平，假设 NNT 沉默后色素沉着的增加是由氧化应激依赖性机制驱动的。实验结果表明，NNT 的敲低导致 UACC257 细胞中 NADP/NADPH 比率的显着增加，且诱导细胞溶质 ROS 增加 (图3c)。而如图 3d-e 所示，抗氧化剂 NAC 和 MitoTEMPO 会抑制 siNNT 介导的色素沉着增加。这些结果表明，NNT 通过依赖氧化还原的机制影响色素沉着。
图 3. NNT 敲低导致黑色素含量增加
a: siNNT 增加 UACC257 细胞的色素沉着; b: 酪氨酸酶敲低对 siNNT 色素沉着的影响; c: siNNT 处理后 UACC257 细胞中的 ROS 的变化; d-e: NAC 或 MitoTEMPO 处理 siNNT 诱导的人 UACC257 黑色素瘤细胞
■ NNT 消耗增强色素沉着，独立于经典的 cAMP-MITF-色素沉着途径
紧接着，作者开始探究 NNT 敲低后色素沉着的机制。首先研究了 NNT 敲低对 UACC257 细胞中关键黑色素生物合成因子的影响：siNNT 使得黑色素生物合成酶酪氨酸酶、TYRP1 和 TRP2/DCT 的水平显着增加 (图4a)，但对 MITF 蛋白和 mRNA 水平均没有太大影响 (图4b)。
经典 cAMP-MITF-色素沉着途径中，cAMP 是紫外线诱导皮肤色素沉着的关键信使，然而，如图 4c，Forskolin (cAMP 激活剂) 并不影响原代黑素细胞以及人皮肤组织在 UVB 照射条件下的 NNT 表达水平。这些结果表明，NNT 依赖性的色素沉着机制独立于 cAMP-MITF 依赖性色素沉着途径。
图 4. NNT 介导的色素沉着机制
a: siNNT 处理 72 小时后 UACC257 黑色素瘤细胞的酪氨酸酶、DCT/TRP2 和 TYRP1 的表达; b: siRNA 转染后 NNT、mMITF 和 TYRP1 的 qRT-PCR 分析; c: Forskolin 处理黑色素瘤细胞和皮肤组织
■ NNT 促进泛素蛋白酶体依赖性酪氨酸酶降解并调节黑素体成熟
改变 NNT 会影响酪氨酸酶和关键黑色素生成酶的蛋白质水平，假设 NNT 会影响某些黑素体蛋白质的稳定性。
如图 5a 显示，siNNT 显着增加酪氨酸酶蛋白的稳定性，抗氧化剂 (NAC 或 MitoTEMPO) 会下调这种稳定性 (绿色框)。MG-132 是一种蛋白酶体抑制剂，可阻抑 NNT 过表达诱导的 UACC257 细胞酪氨酸酶蛋白稳定性降低 (图5b)。
研究者们还观察了原代人类黑素细胞中，NNT 表达对黑素体超微结构的影响。如图 5c 所示，siNNT 导致晚期/色素沉着黑素体 (阶段 III 和 IV) 的显着增加，而 NNT 的过表达会导致向早期/无色素黑素体 (阶段 I 和 II) 的转变 (图5d)，这些结果表明 NNT 通过蛋白酶体介导的酪氨酸酶蛋白降解诱导黑色素水平的变化，并调节黑素体中的成熟。
图 5. NNT 敲低条件黑素体的成熟
a: siNNT 介导的增加的蛋白质稳定性被抗氧化剂阻断; b: MG132 处理过表达 NNT 的 UACC257 细胞; c-d: 黑素体成熟的检测
■ NNT 调节小鼠、斑马鱼和人类色素沉着障碍的色素沉着
2,3BD 是一种 NNT 的抑制剂，如图 6a 所示，在人体皮肤模型上，2,3BD 可显著诱导黑色素沉积。2,3BD 处理还可防止形成 UVB 诱导的 CPD (紫外辐射后的一种光产物)，并且 2,3BD 还显著下调了 γ-H2AX (一种 DNA 双链断裂的标志物) 表达 (6b-c，绿色框)。2,3BD 诱导的色素沉着可以保护人体皮肤免受 UVB 诱导的 DNA 损伤。
研究者们选择了 Nnt 突变纯合子的 C57BL/6J 小鼠模型，与 C57BL/6NJ 野生型相比，如图 6c 所示, NntC57BL/6J 小鼠显示出皮毛色素沉着增加。
此外，如图 6d, 还构建了斑马鱼 NNT 过表达模型，过表达 NNT 的斑马鱼 (NNT OE) 与空质粒斑马鱼胚胎相比，所观察到黑色素细胞内色素沉着减少，使用 2,3BD 处理 NNT OE 鱼阻止了 NNT 过表达诱导的黑素细胞色素沉着减少。
图 6. NNT 敲低条件黑素体的成熟
a: 2,3BD 诱导皮肤色素沉积; b: 2,3BD 处理在 UVB 诱导条件下的 CPD 和 γ-H2AX 的表达变化; c: 纯合子 nnt 敲除鼠色素沉积; d: 过表达 NNT (NNT OE) 的斑马鱼模型
小结：
这篇文章阐明了一种新的依赖于 NNT 的独特色素沉着机制，与经典的 UVB-cAMP-MITF 晒黑途径不同。
研究者们还用不同肤色的人皮肤组织进行了紫外线辐射，发现具有较深色素的皮肤确实受到了保护，免受紫外线造成的DNA损伤。
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参考文献
1. David E. Fisher, Elisabeth Roider, et al. NNT mediates redox-dependent pigmentation via a UVB- and MITF-independent mechanism. Cell. 2021 Jun 29;S0092-8674(21)00757-1
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