H2DCFDA | ROS 荧光探针检测法

H2DCFDA 工作液的配制

1、储存液的配制：用 DMSO 配制 10 mM 的 H2DCFDA (2,000×)，如用 1.03 mL DMSO 溶解 5 mg H2DCFDA。
注：H2DCFDA 储存液建议分装后-20℃ 避光冻存，一个月。-80 半年。

2、工作液的配制：用预热好的无血清细胞培养基或缓冲液 (如 PBS) 稀释储存液，配制终浓度为 5-10 μM 的 H2DCFDA 工作液 (1×)。
注：H2DCFDA 工作液建议现用现配，具体浓度可根据实际情况调整。

细胞染色

■ 悬浮细胞
a) 以 6 孔板为例，接种适量数目的细胞，37℃，培养过夜。
b) 细胞密度达到 80%-90% 后，进行染色处理或阳性/阴性对照处理 (选做)。
c) 阴性对照(选做): 用预热的 1 mL PBS 清洗细胞 2-3 次后，用新鲜制备的 5 mM NAC 37℃ 处理 1 小时（或 0.1 mM H₂O₂ 作为阴性对照_，37℃ 处理 20-30 分钟）。
d) 去除培养细胞的培养基直至无残留，每孔添加 1 mL 1×H2DCFDA 工作液，37℃ 细胞培养箱内孵育 30 分钟。
e) 400 g，4℃ 离心 3-4 分钟，沉淀细胞。弃上清，注意尽量不要吸除细胞。
f) PBS 再次清洗细胞，以充分去除未进入细胞内的 H2DCFDA。
g) 加入 1 mL 无血清细胞培养基或 PBS 重悬细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察，也可以用荧光酶标仪或流式细胞仪分析 (Ex/Em=488/525 nm)。

图 1. 悬浮与贴壁细胞染色流程图 (有对照)。

■ 贴壁细胞
注：若用荧光分光光度计或流式细胞仪检测贴壁细胞，可先对贴壁细胞进行消化、收集，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。


哺乳细胞染色：以 Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway 一文中探针使用为例，研究者先使用 m-THPC 或 Verteporfin 处理 HCT116 细胞，然后使用 H2DCFDA 染色，并通过流式细胞术测量 ROS 的产生。如图所示，HCT116 细胞中 ROS 的产生以时间依赖性方式增加。

图 2. HTC116 细胞用 0.35 μM Verteporfin  处理，流式细胞术检测 ROS 水平^[1]

植物细胞染色：以 FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa 一文为例，在这篇文章中，为了证明 ROS 产生是否参与十字花科植物的自交不亲和反应，对未授粉 (UP)，自花授粉（SI），亲和授粉（CP) 的柱头，进行了 ROS 染色。
结果表明，与未授粉 (UP) 柱头的稳态 ROS 水平相比，自花授粉后 1 min ROS开始显著增加，30 min 内达到最大值 (图 2A)。用 H2DCFDA 和 细胞壁指示剂 PI 共染色柱头，ROS 位于乳头细胞的细胞质中，靠近质膜外围(图 1C)。上述结果表明，自花花粉在大白菜的柱头乳头细胞中触发了高水平的活性氧 (ROS)，可能参与自交不亲和 (SI) 的发生。

图 3. 柱头的ROS染色与质膜完整性共成像^[2] a. 十字花科植物柱头的 ROS染色 b. 共成像

除了上述柱头染色， 还可用于原生质体染色，如图 4 所示，用 H2DCFDA 对原生质体进行染色以检测 ROS 的产生，并通过活细胞成像 (Live-cell imaging) 跟踪整个过程。结果表明，原生质体中的 ROS 水平持续升高。
注：微生物、植物叶片、原生质体、花柱头等的 H2DCFDA 染色浓度及孵育时间，需根据具体植物样本调整。

图 4. 原生质体中 ROS 积累检测^[3]

 HKPerox-2：H₂O₂ 作为一种稳定的活性氧成分，在氧化损伤和细胞信号转导中也是发挥着很重要作用的。下面图 5a 就可以看出对 H₂O₂ 的高选择性。此外，用 H₂O₂ 处理细胞，HKPerox-2 的荧光 30 分钟内就可以到达高峰。染色效果看图5c，亮眼的绿色荧光。使用方法和 H2DCFDA 的差不多。

图5. HKPerox-2 用于 H₂O₂ 检测
a. HKPerox-2 对 H₂O₂ 的选择性 b. HKPerox-2 荧光强度 c. HKPerox-2 细胞染色效果

 HKSOX-1、 HKOH-1r：分别是超氧阴离子自由基 (O₂^·−)和羟基自由基 (·OH) 荧光探针。动物细胞操作同上，使用浓度、孵育时间如有雷同纯属巧合。

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参考文献
1. Changfeng Song, Wen Xu, Hongkun Wu, Xiaotong Wang et al. Photodynamic therapy induces autophagy-mediated cell death in human colorectal cancer cells via activation of the ROS/JNK signaling pathway. Cell Death Dis. 2020 Oct 31;11(10):938.
2. Jijie Chai, Kangmin He, Yu-Hang Chen, Jian-Min Zhou, et al. The ZAR1 resistosome is a calcium-permeable channel triggering plant immune signaling. Cell. 2021 Jun 24;184(13):3528-3541.e12.
3. Lili Zhang 1, Jiabao Huang 2, Shiqi Su 1, Xiaochun Wei 3, Lin Yang 1, Huanhuan Zhao 1, Jianqiang Yu, et al. FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa. Curr Biol. 2021 Jul 26;31(14):3004-3016.e4