冻融是生物药生产中必须的过程，如在生产工艺不同步骤的等待过程，或变换厂区/转移等，也是原液长期保存的常用方法。另外，在成品运输或患者在家使用时也可能造成偶然性冻融。某些蛋白质对冻融非常敏感，特别是在无合适保护剂的情况下，极易造成蛋白质失活。所以，冻融实验也是制剂处方筛选必不可少的一部分。蛋白质冻融破坏的机制有以下几种：首先，冷冻过程中形成的冰水表面是蛋白质变性的重要原因，蛋白质倾向于吸附到这些表面中发生变性和聚集；其次，冷冻过程中大量的水结成冰后剩余溶质及蛋白质本身的浓度会急剧增加，而蛋白质浓度越高，发生分子间碰撞机会越多，则形成聚集就越严重。

根据蛋白质降解的反应机制，抑制冻融造成的蛋白质降解也有不同方式。如通常可加入表面活性剂（如聚山梨酯20、聚山梨酯80等）来抑制由冰水表面引起的降解。通过调节溶液pH和离子强度，加入辅料/保护剂的形式来增加热力学稳定性（使蛋白质维持在天然状态下）。长期储存生物药原液时，通常需要把蛋白质保存在最大冻结浓缩液的玻璃化转变温度以下，确保其具有非常低的运动性（动力学稳定性）。如含有蔗糖作为保护剂的蛋白质溶液，由于其Tg约为-30℃，那就需要保持在-40℃甚至更低的温度下。冻融的速率也会影响生物药的稳定性。如冷冻过慢会导致蛋白质长时间在较高浓度状态下，更易发生降解；相反，如在非常快的条件下（如放在-80℃）可能会形成大量的冰水表面，也会引起由于表面造成的降解。融化的速度也非常重要，缓慢的融化（如4℃）会导致在冰水表面融化的水重结晶而造成进一步的破坏。所以生产过程中一般建议尽量在较快速度下对冷冻产品进行融化，如使用流动水来加速融化。

另外，在冷冻过程中，某些溶质会由于冰的形成以及溶解度降低而结晶析出。最典型的是磷酸钠缓冲液，与磷酸二氢钠相比，磷酸氢二钠的溶解度对温度非常敏感，在低温条件下会首先析出，从而导致溶液的pH下降最多达3～4个单位，此时对酸敏感的蛋白质则易发生降解。某些具有多个亚基结构的蛋白质，如aponeocarzinostatin和葡萄球菌核酸酶等，由于连接亚基的疏水作用随温度下降而降低，在低温条件下会发生低温变性。