类器官简介
类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。尽管类器官并不是真正意义上的人体器官，但能在结构和功能上模拟真实器官，能够最大程度地模拟体内组织结构及功能并能够长期稳定传代培养。
类器官的种类
类器官的发展史
早在 20 世纪 80 年代，“organoid”一词就已经提出, 1907年，美国贝克罗莱那大学教授威尔逊发现通过机械分离的海绵细胞可以重新聚集并自组织成为新的具有正常功能的海绵有机体，是未来类器官技术发展的源头。威尔逊的研究证明了成年的有机体在无需外界帮助、无需从特定的解剖学阶段开始，也具有完整的信息并可以成功发育成新的有机体。当代类器官的发展成果，主要集中在近十余年。2009年，Hans Clevers实验室使用单个鼠LGR5+肠干细胞在体外自组织成为具有肠隐窝-绒毛结构的肠类器官，开启了类器官发展的新篇章。
目前，多种脏器类器官已被成功构建，其中包括小肠、胃、结肠、肺、膀胱、大脑、肝脏、胰腺、肾脏、卵巢、食道、心脏等，不仅包括正常器官组织类器官，还有相应肿瘤组织类器官。近几年涉及类器官研究的文献数量呈直线上升趋势，其中不乏多篇CNS等各大顶级期刊文献。中国发表的类器官文献数量在全球的排名从第六位（2009-2019年）跃至第二位（2020年），今次与美国。2021年，类器官被列为“十四五”国家重点研发计划重点专项，随着相关研究不断深入，我国类器官技术水平将进一步提升，同时在相关企业积极布局下，类器官市场化程度将不断提升。
类器官研究发展进程
类器官模型与其他模型比较
目前主要应用临床药物筛选的模型主要分为2D细胞模型，3D类器官和人源性动物移植模型（PDX）。其中肿瘤药物筛选模型需要满足在短时间内出具药敏检测结果、药物筛查通量高、预测效果准确这三个方面，而类器官在这三方面对比其他药筛方法都显现出了强劲优势。
药筛模型对比（来源：中国网医疗频道）
特点2D细胞模型类器官PDX
生理变现局限性模型半生理模型生理模型
构建时间短适中较长
建模成功率高高低
药物检测通量很高高低
成本低适中高
样本量要求少较小活检/手术组织较大活检/手术组织
血管化、免疫系统不具备不具备具备
操作难以程度容易容易困难
基因编辑容易容易困难
肿瘤异质性难以实现可保留难以实现
临床相关性低高高
生物库建立可操作可操作难以实现
类器官模型的应用
类器官培养
以小肠类器官培养为例操作方法：
实验材料
名称
参数
注意
基质胶
提前化冻
基础培养基
B27 50x；N2 100x；N-Acetyl-L-cysteine1mM；Glutamax100x；HEPES 10mM ；Primocin500x；AdvancedDMEM/F12, ADMEM；细胞因子：Mouse-EGF（鼠源的表皮生长因子）50ng/ml；HumanR-spondin1 500ng/ml；Mouse-noggin（BMP的抑制剂） 100ng/ml
培养基配置时一次不要太多，建议一次配20ml，配制好后用0.22um的滤器过滤（过滤的目的是除菌），置于4℃可保存4周。
24孔细胞培养板
PBS
灭菌，预冷且加入双抗
实验方法
隐窝分离及接板:
（1）解剖6-8周的小鼠，取胃以下约10cm的小肠，镊子去肠系膜，剪刀沿肠道剪开，用预冷的PBS洗3-5次，用载玻片小心的将小肠表面的绒毛刮去（显微镜下镜检），将刮好的小肠放入50ml离心管中，置于冰上；
（2）将小肠转移至生物安全柜中，用含双抗的PBS清洗3-5次，将小肠转移至25ml 2mmol/L的EDTA的溶液中4℃冰箱中消化30min；
（3）将消化好的小肠转移至50 ml离心管中用含双抗的PBS 清洗2次；
（4）加入25ml PBS适当摇晃30-50下，取部分悬液镜检。悬浮液用70um的过滤筛过滤到新的50ml离心管中；
（5）重复步骤4，两次收集的滤液800rpm 离心5min；
（6）弃上清，用2ml的ADMEM重悬沉淀，取适量的悬液计数；隐窝的数量控制在5-15个/ul 最佳；
（7）取适当体积的悬液加入到1.5ml的离心管中，室温下800rpm离心5min；
（8）弃上清，用预冷的基质胶重悬（需充分混匀）；
（9）接板，24孔板接50ul的重悬液（注：基质胶种在孔中间避免贴壁）；
（10）将接种好的板于培养箱中放置20-30min；
（11）每孔加500ul完全培养基，然后每隔2-3天换一次培养基，5-7天传代一次。
注：所有的操作都要避免染菌，且组织需尽可能至于冰上。
小肠培养流程图
类器官传代:
（1）将传代的隐窝冰上放置5-10min；
（2）小心吸出上清，并加入预冷的1ml 的ADMEM用大枪头将基质胶打碎，然后调制700ul量程，吹打30下左右，此过程避免产生气泡。可取适量的悬液观察，直至看不到大块的隐窝为止；
（3）将悬液转移至1.5ml离心管中，室温800rpm离心 5min；
（4）后续接板步骤与隐窝接板步骤第8-11步一样。
注：理论上传一次可以扩增3-5倍，但由于操作过程中的损失，因此一般只能扩增3倍。
冻存及复苏：
10%的DMSO，20%FBS，ADMEM补足，将悬液转移至冻存管后，放入冻存盒中于-80℃冰箱中保存24h，若长久保存，24h后需放入液氮罐中保存。复苏参照复苏细胞方法。
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