随着多重荧光免疫组化技术的不断发展,越来越多老师希望在自己的片子上看到更丰富的靶标信息,意味着我们需要用到更多种荧光染料去完成染色,但由于荧光染料产生的信号不是单纯的线性,而是呈现山峰状的分布,在最高点信号固然最好,但在最高点左右的一段范围内都能够捕获到它的信号,那么相邻的染料之间,难免会有信号的重叠,导致最后的结果无法被准确判读。
不同荧光染料光谱示意图
mIHC结果出现信号重叠,一般表现为两种情况:
1、信号完全重叠,没有各自独立信号存在(理论上指标间不存在共定位)
图1:左:merge;中:CD4;右:CD8
2、有各自独立的阳性信号,但大部分信号高度重叠(理论上共定位信号没有那么多)
图2:左:merge;中:CD3;右:CD8
图3:红箭头:共定位信号;白箭头:CD8信号
可能原因:选用波长十分相近的荧光染料进行了染色;前一轮染色的抗体没有洗涤干净
解决方案:
1、在选择荧光染料的时候,选择相距波长较远的荧光染料,以Absin的多色试剂盒为例,选择四色(TSA520、TSA570、TSA650、DAPI)、五色(TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、DAPI)和七色plus(TSA480、TSA520、TSA570、TSA620、TSA700、TSA770、DAPI),这几个试剂盒里的染料之间是几乎不会有串扰的情况。如染料TSA540跟TSA520、TSA570的荧光波长挨得十分接近,TSA650和TSA620挨得很近,在做染料选择的时候就要避开同时应用,比如已经用了TSA520,那在同一个项目中就不要用TSA540再进行染色;如果无法避免必须要同时用,就需要扫描仪或者显微镜具有光谱拆分的功能,完成扫描以后再在工作站进行通道的拆分优化,但至于拆分的效果也取决于染色和成像的效果,所以为了得到一个不错的结果,可能需要实验者不断地调试与优化实验的条件。
2、如果所使用的染料之间本身间隔较远,不存在光谱重叠度过高的情况,那出现这种信号的高度重叠,多半是因为前一轮抗体没有洗脱干净,且前一轮的一抗来源恰好跟后一轮相同,当前一轮没有洗干净的时候,残留的一抗也会跟后一轮的二抗结合,导致信号出现重叠。需要优化洗脱的条件。修复液+高压的条件基本都能洗脱得比较干净,但因为条件较强,很容易出现组织从片子上脱落的情况;如果是选择修复液+微波加热的方式,那就需要优化微波修复的条件,Absin实验室推荐可以采用先高火煮沸修复液,取出修复盒后快速插入待洗脱/修复的切片,盖盖子后继续放入微波炉低火维持15min,如果最后洗脱效果不理想,可以延长低火维持的时间,或者调整微波炉的功率,不同微波炉的火力和功率有区别,需要根据具体的实验结果进行更改;如果是选用Absin抗体洗脱液(abs994),则需要关注没洗干净的指标是否是一些较难洗脱的蛋白,如结构蛋白、细胞骨架蛋白、胞浆胞核蛋白,考虑需要延长洗脱的时间或更换更强的洗脱方式(如热修复),或者将难以洗干净的蛋白放到最后顺位去染色。
3、当两通道各自存在独立信号,但出现大量非特异性共定位重叠信号:
① 如图3所示,真正的共定位信号两指标荧光都很强,而非特异性的共定位信号一个指标很强,另一个指标很弱,较容易区分,在不调整实验的情况下,可以通过调整仪器的曝光时间来改善(如图中在CD8通道出现了比较弱的CD3信号,减少CD8通道的曝光时间),因为越长的曝光时间,越容易把背景和相近通道的信号曝光出来。
② 避免把会存在共表达的指标搭配波长相近染料,如CD3应用了TSA570,则CD8避开使用TSA620,可以选用相距较远的TSA700或TSA520;另外在染色的时候,根据前期预实验的结果,微调各指标的染色条件,比如单标染色发现CD3信号非常强,CD8相对CD3弱很多,在多染的时候染CD3可以再降低抗体浓度,缩短抗体孵育时间,以及染料孵育时间,或CD8增高抗体浓度,延长孵育时间,再搭配曝光时间的调整,也能有效避免信号串扰问题。
③ 如果仪器可以控制拍摄不同通道的顺序,相邻的通道也可以间隔开拍摄,因为荧光信号被激发以后,在信号比较强的情况下,会在片子上留存一段时间,如果紧接着拍摄邻近的通道,有可能这个邻近通道也会接收到上一个通道的残留信号,因此可以考虑间隔开拍摄。
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