术中冰冻制片技术是病理学常用技术，采用快速冷冻的方法将新鲜手术病理组织冷冻硬，使用恒温冰冻切片机将冷冻变硬的组织切成薄片，组织薄片粘贴与载玻片上，经过固定、苏木素 —伊红染色、脱水、封片等系列技术操作制成术中冰冻组织切片，用于手术过程中的快速病理诊断。
术中冰冻制片手工操作规范流程
1）恒温冰冻切片工作状态温度设置：
a、速冻台温度：尽可能低（-30℃ ~-40℃）
b、箱体的温度设置： -16℃ ~-20℃
c、样本头的温度设置：一般软组织： -15℃ ~-20℃，含多量脂肪组织： -30℃ ~-45℃
2）制片前准备： 速冻锤放置在速冻台上预冷，干净而干燥的组织托放入冰冻机箱体中预冷；
3）取材：1.5×1.5cm×0.5cm，组织厚度决定了组织冷冻的速度，为影响冰冻切片质量的重要因素；同时应尽量剔除脂肪组织、钙化、骨质等影响切片质量的成分。
4）使用优质不掉纸屑吸水纸（滤纸或擦手纸）将组织表面的水分充分吸干，尤其是含组织液或血液较多的组织。
5）将组织托放上速冻台，加入冰冻包埋剂少量，待底部变白但表面未凝固时放上组织，加盖少量包埋剂，加冻锤速冻组织（用液氮直接冷冻效果更好，可有效减少组织与细胞内冰晶形成），注意保持组织冷冻切面的水平。
6）使用纸质小标签对冷冻组织块进行编号，号码与取材记录的编号对应。
7）注意粗修组织的深度，尽量切取靠近冻锤面的组织，切片厚度4~6μm。
8）冰冻切片贴片后立即浸入冰冻固定液中固定10~20 秒；
9）流水清洗切片10~60 秒，洗净固定液（如使用单纯的脱水型固定液，则避免固定后水洗）；
10）苏木精染液染1 分钟（室温25℃），室温低需适当延长染色时间；
11）水洗3~5 秒；
12）返蓝液3~5 秒或温水返蓝；
13）流水充分冲洗20~60 秒，充分洗净返兰液；
14）伊红染色液2~5 秒，抖动切片促进染色均匀；
15）75% 乙醇1 缸5~10 秒，分化伊红；
16）95% 乙醇1 缸5~10 秒；
17）无水酒精2 缸各5~10 秒，抖动玻片促进脱水效果；
18）500 毫升透明剂3 缸，每缸各10~30 秒，充分抖动玻片促进透明效果；
19）封片剂封片。
（如果您使用的是赛默飞世尔科技的HE染液，可以免去步骤15。）
术中冰冻切片技术质控要点
1）冰晶形成：细胞外冰晶形成与细胞内冰晶形成；
导致冰晶形成的原因是组织冷冻速度不足够迅速，组织内的水分子在冷冻的过程中聚合形成晶体态结晶，冰晶形成的位置大部分位于细胞之间称为细胞外冰晶，冰晶的位置位于细胞质和/ 或细胞核内称为细胞内冰晶。胞外冰晶使细胞间出现不规则空隙并同时出现细胞收缩、组织结构变形；细胞内冰晶形成导致细胞浆和/ 或细胞核内细微结构改变甚至消失。冰晶的形成会严重影响冰冻快速诊断准确性，避免冰晶形成是冰冻制片最重要的质量保证。尽可能快速的冷冻组织是减少冰晶形成的主要手段。
（肾缓慢冷冻后产生的冰晶）
■ 速冻的关键是： ✔必须将样本托放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。
✔ 冷冻取材必须注意组织不能太大，太厚，一般厚度大约在1mm左右，大小为10-20mm。组织越大越厚，冷冻速度就越慢。
在样本托上打上少量的底胶，待胶有3/4冻住后再把组织放上去。胶太多，会影响冷冻的速度，因此胶的量要适中。组织与胶面积的比例也很重要，不要把样本托全部放满，最好留有1/4以上的空间。尽可能选择30-40cm大小的样本托，样本托越大，所聚的能量越多，组织越容易冷冻。（也可以在冷的样本托上直接放组织，再在组织周围补点胶，但这种方法优势容易与样本托分离）。
将速冻锤轻轻压在组织上，待组织能与速冻锤分开后即可切片（也可以将样本托与组织放入液氮中处理，在液氮中冷冻时注意不要冻过头，3-5秒就要拿出来看一下，只要有4/5的面积冻住就可以了，否则也会引起组织发脆，样本托与组织脱离）
2）冰冻切片操作的质量：包括空洞、裂隙、皱褶、刀痕、贴片位置等。
影响因素有冰冻切片机的性能与运行状态，切片操作的规范性、技术人员对冰冻切片机的熟悉程度与切片操作经验等。
3）固定与染色质量：组织结构的完整性与清晰度、苏木素与伊红的染色质量、透明、是否有污染的情况等。影响因素有固定液的选择、冰冻制片试剂的质量、固定与染色流程的规范性、冰冻切片染色机的性能与运行状态、技术人员对冰冻染色的操作经验等。
4）其他制片操作的质量：封片的质量、标签的清晰度与粘贴质量等。
术中冰冻制片质量评分表
评分：
甲级片（优）90 以上，乙级片（良）80-89 分，丙级片（合格）60-79 分，丁级片（不合格）< 60 分。
冰冻切片合格率100%、优良率＞ 85%。
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