内容
人脑内各种神经递质协调工作，控制着记忆、情绪等各种大脑功能。 在这些神经递质中，多巴胺和去甲肾上腺素被认为具有相似的化学结构，在很多脑功能中相互参与。 因此，调查多巴胺和去甲肾上腺素(也称为去肾上腺素)在何时何地释放出多少，是阐明复杂的大脑功能所必须的。 但是，由于多巴胺和去甲肾上腺素在结构上非常相似，在生物体内很难特异地、高灵敏度和高时间和空间分辨率地观察它们。 这次，基础生物学研究所定量生物学研究部门/生命创成探索中心定量生物学研究组的后藤祐平助教、青木一洋教授、丹麦奥胡斯大学的中本千寻博士研究员、竹内伦德副教授等，通过生理学研究所的深田正纪教授、丹麦哥本哈根大学的Gloriam教授等的共同研究，获得了红色荧光蛋白 利用该红色荧光多巴胺传感器对多巴胺的高选择性，与早先报道的绿色荧光去甲肾上腺素生物传感器一起使用，成功地用一个细胞同时可视化了多巴胺和去甲肾上腺素。 该成果于2021年12月06日发表在英国学术杂志《Molecular Brain》上。
研究背景 以人为首的动物脑内许多神经细胞复杂地协调工作，控制着记忆、情绪、运动功能等各种各样的脑功能。 谷氨酸、GABA、多巴胺和去甲肾上腺素等神经递质用于神经细胞之间的信号传递。 各个神经细胞释放这些物质，接收侧的神经细胞通过受体感知这些物质，从而进行信息的传递(图1 )。
图1 :通过神经细胞传递信息的概念图。 神经细胞释放的神经递质通过由接收侧神经细胞表达的受体接受来传递信息。 通过在神经细胞中表达生物传感器，可以将释放出的神经递质可视化。
在这些神经递质中，多巴胺和去甲肾上腺素被认为具有类似的化学结构，在很多脑功能中相互协调地工作。 因此，测量多巴胺和去甲肾上腺素在何时何地从神经细胞中释放出了多少，是阐明复杂的大脑功能所必须的。 但是，由于多巴胺和去甲肾上腺素在结构上非常相似，在生物体内很难特异地、高灵敏度和高时间和空间分辨率地观察它们。 因此，本研究小组着眼于使用荧光蛋白质的生物传感器。 使用荧光蛋白质的生物传感器在时间和空间上的分辨率较高，近年来作为几种神经递质的检测方法被广泛开发。 这个生物传感器是在神经递质的受体( g蛋白质共轭型受体)中融合了荧光蛋白质，将接受神经递质时受体的结构变化转换为荧光蛋白质的荧光亮度的变化。 他认为，通过在任意神经细胞中表达该生物传感器，可以以高时间和空间分辨率，同时将神经细胞外的多巴胺和去甲肾上腺素可视化。 但是，要同时将多巴胺和去甲肾上腺素可视化，存在两个问题。 第一，现有的多巴胺生物传感器和去甲肾上腺素生物传感器是基于绿色荧光蛋白质制作的，因此无法区分多巴胺和去甲肾上腺素并使其可视化。 第二，由于多巴胺和去甲肾上腺素的化学结构相似，已知现有的多巴胺生物传感器在某种程度上也会对去甲肾上腺素产生反应。 因此，着手开发了对现有的绿色荧光去甲肾上腺素生物传感器和同时可视化的多巴胺具有高选择性的红色荧光多巴胺生物传感器。 研究成果
本研究首先对可以用红色荧光观察多巴胺的生物传感器进行了筛选。 以5种人类多巴胺受体中称为DRD1的受体为骨骼，将与细胞内信号转导分子结合相关的细胞内侧第3环( ICL3)置换为红色荧光蛋白质的圆序列突变体cpmApple (图2左)。 DRD1接受多巴胺后，受体的结构发生变化，并向ICL3传递其结构变化。 插入的cpmApple由于其结构变化，荧光亮度发生变化，因此是荧光亮度随细胞外多巴胺浓度变化的生物传感器。 研究小组将这种红色荧光多巴胺生物传感器命名为“红色通用编码GPCR活动报告器为DA ( r-Gengar-DA )”。 为了高效地将结构变化转换为荧光亮度变化，连接DRD1和CPM苹果的连接位点的氨基酸序列很重要。 于是，在连接体部位导入随机变异，筛选出多巴胺引起的荧光亮度变化变大的变异体。 制作了近800种变异体文库，通过成像调查了每个变异体对多巴胺的响应性。 结果，对多巴胺响应最大的突变体被命名为“R-GenGAR-DA-1.1”(图2右)。
图2 .红色荧光多巴胺生物传感器的制作策略。 (图左)以人多巴胺受体DRD1为基础，向细胞内侧第3环( ICL3)插入红色荧光蛋白质的圆序列突变体cpmApple。 多巴胺结合后，DRD1的结构发生变化，CPM苹果的荧光亮度就会发生变化。 (图右)在连接部位加入随机变异，筛选出荧光亮度值变化较大的变异体。
R-GenGAR-DA-1.1与去甲肾上腺素相比，对多巴胺的特异性不太高(13倍左右)，因此进一步进行了生物传感器的优化。 具体而言，在R-GenGAR-DA-1.1的多巴胺结合部位、DRD1保存的区域和连接部位的周围，进行了氨基酸的置换或插入。 结果发现，在连接位点n末端插入谷氨酰胺的突变体“R-GenGAR-DA-1.2”作为传感器具有优异的性质(图3左)。 R-GenGAR-DA-1.2的荧光亮度因投用多巴胺而减少(图3右)，荧光亮度减少量随多巴胺浓度而变化。 另外，对多巴胺的选择性比去甲肾上腺素高6.6倍(图3左下)，有望在生物体内也能分辨多巴胺和去甲肾上腺素。
图3 .在连接位点导入变异的R-GenGAR1.2对多巴胺有很高的特异性。 (图左) R-GenGAR1.2的示意图(上)。 R-GenGAR1.2与去甲肾上腺素( NE )相比，对多巴胺的特异性较高(下)。 (图右)对表达R-GenGAR-DA1.2的人培养细胞(上)以及大鼠神经原代培养细胞(下)进行多巴胺( DA )刺激后，注射了DRD1的抑制剂( SCH )。 用伪彩色表示荧光亮度的变化。
最后，R-GenGAR-DA-1.2显示出对多巴胺的高选择性，因此对现有的去甲肾上腺素显示出高选择性的绿色荧光去甲肾上腺素生物传感器( GRABNE1m，Feng et al .，2019，。 准备了共表达R-GenGAR-DA-1.2和GRABNE1m的HeLa细胞以及大鼠原代神经培养细胞，分别注射了多巴胺和去甲肾上腺素。 利用多重荧光成像法观察红色荧光和绿色荧光的增减，成功地分别用一个细胞观察到了投用多巴胺和去甲肾上腺素的情况(图4 )。
图4 .多巴胺和去甲肾上腺素的多重荧光成像。 (图上)表达R-GenGAR-DA-1.2和GRABNE1m的HeLa细胞。 依次给予去甲肾上腺素( NE )、多巴胺( DA )、α2肾上腺素受体抑制剂( YO )、DRD1抑制剂( SCH )。 右图用伪彩色表示了左图中由四边形包围的区域中各个生物传感器的荧光亮度变化。 (图下)表达R-GenGAR-DA-1.2和GRABNE1m的大鼠神经原代培养细胞。 依次给予去甲肾上腺素( NE )、多巴胺( DA )、α2肾上腺素受体抑制剂( YO )、DRD1抑制剂( SCH )。 右图中的图表表示了左图中由四边形包围的区域中各个生物传感器的荧光亮度变化。
本研究的课题和今后的展望 本研究制作了对多巴胺选择性高的新型红色荧光多巴胺生物传感器“R-GenGAR1.2”，与已报道的对去甲肾上腺素显示高选择性的绿色荧光去甲肾上腺素生物传感器相结合，得到了多巴胺 但是，要想使用该红色荧光多巴胺生物传感器在动物个体内对多巴胺进行成像，还需要进一步改良。
发表杂志
杂志名称Molecular Brain
刊登日2021年12月06日
论文标题: a novel red fluorescence dopamine biosensor selectively detects dopamine in the presence of nor epinephrine in in vitro (其他企业互联互通的选择性检测技术)。
作者: Chihiro Nakamoto*, Yuhei Goto*, Yoko Tomizawa, Yuko Fukata, Masaki Fukata, Kasper Harpsøe, David E. Gloriam, Kazuhiro Aoki**, Tomonori Takeuchi**
(*co-first authors, **co-corresponding authors)
DOI：https://doi.org/10.1186/s13041-021-00882-8
研究小组 本研究由基础生物学研究所/生命创成探索中心的青木一洋教授小组、丹麦奥胡斯大学的竹内伦德副教授小组、生理学研究所的深田正纪教授小组、丹麦哥本哈根大学的Gloriam教授小组共同进行。
研究支持 本研究是在下述补助金的支援下实施的。 日本学术振兴会科研费青年研究( 19K16050 :后藤祐平) 日本学术振兴会科研经费基础研究( b ) ( 18H02444 :青木一洋) 日本学术振兴会科研费新学术领域研究“以信息物理学为基础的生命秩序和设计原理”( 19H05798 :青木一洋) 科学技术振兴机构CREST(JPMJCR1654 :青木一洋)
关于本研究的咨询 基础生物学研究所定量生物学研究部门 生命创成探索中心定量生物学研究小组 教授青木一洋 准教授竹内伦德 生物医学部门，地球大学 新闻负责人 基础生物学研究所宣传室 自然科学研究机构生命创建探究中心研究合作推进室 生理学研究所研究能力强化战略室
租赁来源
自然科学研究机构基础生物学研究所 自然科学研究机构生命创建探索中心 自然科学研究机构生理学研究所 相关部门 生物膜研究部门 相关研究者 深田正纪 教授 深田正纪
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