人iPS细胞直接诱导视细胞的方法-可以迅速简便地分化诱导视细胞-

2022年3月29日 理化研究所 京都大学iPS细胞研究所 京都大学研究生院医学研究科 人iPS细胞直接诱导视细胞的方法-可以迅速简便地分化诱导视细胞-

理化学研究所(理研)生物资源研究中心iPS制药基础开发小组大冢悠生研修生(京都大学研究生院医学研究科眼科学讲座研究生)、今村惠子客座研究员(京都大学iPS细胞研究所特定据点讲师)、井上治久小组组长(京都大学iPS细胞研究所教授)、 京都大学研究生院医学研究科眼科学讲座辻川明孝教授等人的联合研究小组发现，通过表达特定的转录因子[1]，可以在短时间内从人工多能干细胞( iPS细胞) [2]分化诱导视网膜的构成细胞视细胞[3]。 本研究成果有望为以视网膜变性疾病[4]为首的视细胞相关研究的疾病建模和治疗药物的探索做出贡献。 迄今为止，虽然进行了从iPS细胞分化诱导构成视网膜的细胞的研究，但是需要花费时间，需要经过多个步骤成为了课题。 此次，联合研究小组通过向人iPS细胞导入转录因子CRX和NEUROD1并使其暂时性地过度表达，构建了比以往的分化诱导方法更短时间、更进一步地在视细胞表达特异性基因的诱导型视细胞样细胞(以下称为诱导视细胞)的方法 通过单细胞RNA分析[5]，分析诱导视细胞的转录子[6]，发现表达了各种光传递相关基因。 制造的诱导视细胞在钙成像[7]中显示了其功能特性。 此外，在使用诱导视细胞的光伤害模型[8]中，光诱导性细胞死亡受到了抗氧化物质的给药的抑制。 本研究于3月8日刊登在在线科学杂志《iScience》上。

由人iPS细胞制备诱导视细胞的方法示意图

背景 在眼球内感受光的视网膜中，视细胞是感受光的主要组成细胞。 视网膜变性疾病是视细胞变性的进行性疾病群，会引起不可逆的视力下降。 视网膜变性疾病有很多病例病情不明，根本的治疗方法还不存在。 在研究这些疾病时，iPS细胞技术对视细胞的产生、试管内疾病模型的制作都很有用。 到目前为止，已经报道了几种制造视细胞的分化诱导法。 另外，近年来，关于诱导具有与生物体相近结构的三维视网膜有机化合物[9]的研究也在进行。 但是在这些方法中，存在为了制作视细胞需要长时间的培养和多个步骤的课题。

研究方法和成果 共同研究小组以在更短的时间内，极力减少步骤数，分化诱导视细胞并制作为目标，关注了一种叫做“直接诱导法”的技术。 该方法是通过在体细胞中强制表达对细胞系统决定重要的基因，从而转换为目标系统细胞的技术。 实际上，通过这种方法，已经报道了全身的各种细胞可以由体细胞制作出来。 但是，由于体细胞需要从皮肤和血液中采集，细胞分裂的次数也有限，所以可以使用的细胞数量有限。 另一方面，iPS细胞除了具有分化为各种组织和内脏器官细胞的能力之外，还具有几乎无限增殖的能力。 因此，尝试构建了向人iPS细胞导入转录因子直接分化诱导，制作视细胞的方法。 结果发现，通过将视细胞发生过程中重要的CRX和NEUROD1这两个转录因子导入人iPS细胞进行培养，可以在14天以内的短时间内制备在视细胞中表达特异性基因的诱导型视细胞样细胞(以下称为诱导视细胞)。 另外，通过将培养期间延长到第28天，发现表达了作为其他视细胞标记物的基因，更接近生物体内的视细胞(图1 )。

图1人iPS细胞诱导的视细胞免疫染色图谱

左)由导入转录因子CRX和NEUROD1的人iPS细胞分化诱导后，第28天细胞用特异性标记(绿色)染色成视细胞的图像。 标尺为50微米( μm，1μm为千分之一毫米)。 右)左图虚线包围的部分放大后的内容。 可见特征细长形态诱导的细胞。 比例尺为50μm。

另外，进行单细胞RNA分析，详细调查诱导视细胞的转录子，发现与视细胞发生相关的各种基因和与光信号传导相关的基因被激活了很多。 因此，为了调查诱导视细胞实际上是否保持了功能特性，给予了可以模仿光刺激的试剂(膜透过性cGMP模拟)，并通过钙成像观察了其响应。 结果表明，诱导视细胞对该试剂有反应，特别是在一些细胞中，会发生距基线30%以上的大变化(图2 )。 这些结果表明，与传统方法相比，在分化开始后28天的短时间内，能够制备表达视细胞特异性蛋白质组的功能性细胞。

图2诱导视细胞功能评价

左)分化诱导后第28天诱导视细胞用钙指示剂标记。 可以确认，通过投用模仿光刺激的试剂，细胞的荧光强度有所增加。 比例尺为50μm。 右)左图箭头诱导视细胞荧光强度变化曲线图。 横轴表示时间，纵轴表示荧光强度变化。 给药后荧光强度增加了约30%左右。

并且，为了确认该诱导视细胞是否可以应用于疾病研究，建立了“光伤害模型”。 在对诱导视细胞照射白色LED光的同时培养24小时，表达光接受蛋白视紫红质的诱导视细胞数量因光照射而明显减少(图3 )。 另一方面，如果在光照前向培养基中添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸，则抑制了视紫红质阳性诱导细胞数量的减少。 也就是说，发现光诱导的细胞死亡会被抗氧化物质的给药抑制。 这些结果显示，本研究制作的诱导视细胞可能对视细胞疾病的疾病模型和治疗药物探索有用。

图3光伤害模型示意图 对培养28天的诱导视细胞照射白色LED光24小时后，表达视紫红质的细胞(绿)数量比在暗处培养的细胞减少。

今后的期待 本研究表明，直接诱导法应用于人iPS细胞的视细胞诱导，比传统的分化诱导法更快地制备人的视细胞。 今后，通过研究能够更高效地制作视细胞的培养条件，结合目的细胞筛选的纯化方法，有望建立利用诱导视细胞的视网膜变性疾病的疾病模型和探索治疗药物。

补充说明 1 .转录因子 参与促进或抑制写入基因( DNA )的遗传信息向RNA转录的蛋白质组。 已鉴定出约2，000多种蛋白质。 2 .人工多能干细胞( iPS细胞) 脊椎动物的初期胚胎等具有的分化为所有种类的体细胞的能力被称为多能性。 具有多能性，可以在试管内培养无限增加的细胞叫做多能干细胞。 iPS细胞是向成人血液和皮肤细胞中导入Oct3、Sox2、Klf4基因等人工制作的具有多能性的干细胞。 3 .视细胞 是构成视网膜的细胞之一，承担着接受光并将光信号传递到视网膜内其他神经细胞的重要作用。 视细胞大致可分为锥体视细胞和杆体视细胞两种。 锥体视细胞用于明亮的地方，杆体视细胞用于黑暗的地方看东西的时候。 4 .视网膜变性疾病 这是一种严重的疾病，导致包括失明在内的强度视力障碍，在构成视网膜的细胞中，作为光受体的视细胞因年龄增加和遗传原因等而变性脱落。 代表性的有视网膜色素变性。 5 .单胞RNA分析 使用新一代可编程控制器，从质和量上全面调查各个细胞保持的整个mRNA的方法。 结合维度压缩等数学分析，可以根据基因表达状态进行细胞分类，可以鉴定传统组织学或细胞生物学方法无法知晓的新细胞种类和推测细胞状态。 6 .转录子 细胞中存在的所有转录产物(编码蛋白质的mRNA、不编码蛋白质的非编码RNA、微RNA等)的总体。 转录因子与基因组不同，无论是同一个体还是每个组织，甚至根据发生阶段、细胞外环境、刺激而变化。 7 .钙成像 一种测定细胞中钙离子流动，直接观察活动中细胞中钙离子浓度变化的方法。 在脑细胞的研究等中被广泛利用。 8 .光伤害模型 老鼠等动物模型，以及由视网膜建立的株化细胞，如果持续照射一定光量的光，就会发生细胞死亡。 在此基础上进行视网膜变性疾病病情调查和治疗药物探索的方法。 9 .有机化合物 试管中由干细胞制造的微型器官。 利用干细胞的自我复制能力和分化能力，通过自我组织形成三维的组织样结构。研究支援：本研究在日本医疗研究开发机构( AMED )再生医疗实现据点网络计划“iPS细胞研究核心据点(研究开发分担者:井上治久)”以及iPS细胞基金的支持下进行。原论文信息 Yuki Otsuka，Keiko Imamura，Akio Oishi，Takayuki Kondo，Mika Suga，Yuichiro Yada，Ran Shibukawa，Yasue Okanishi，Yukako Sagara Akitaka Tsujikawa，Haruhisa Inoue，" one-step induction of photo receptor-like cells from human ipscs by delivering transcription facton 主讲人 理化研究所 生物资源研究中心iPS制药基础开发小组 队长井上治久 (京都大学iPS细胞研究所教授) 客座研究员今村惠子 (京都大学iPS细胞研究所特定据点讲师) 研修生大冢悠生 (京都大学研究生院医学研究科眼科学讲座研究生) 京都大学研究生院医学研究科眼科学讲座 教授辻川明孝 新闻负责人 理化研究所宣传室新闻负责人 在新的联系表选项卡中打开 京都大学iPS细胞研究所( CiRA )国际宣传室 Tel: [phone] email:media [ at ] cira.Kyoto-u.AC.jp 京都大学研究生院医学研究科 email:060 k-kou Hou [ at ] mail2.ADM.Kyoto-u.AC.jp ※上述[at]请替换为@。

补充说明 1 .转录因子 参与促进或抑制写入基因( DNA )的遗传信息向RNA转录的蛋白质组。 已鉴定出约2，000多种蛋白质。 2 .人工多能干细胞( iPS细胞) 脊椎动物的初期胚胎等具有的分化为所有种类的体细胞的能力被称为多能性。 具有多能性，可以在试管内培养无限增加的细胞叫做多能干细胞。 iPS细胞是向成人血液和皮肤细胞中导入Oct3、Sox2、Klf4基因等人工制作的具有多能性的干细胞。 3 .视细胞 是构成视网膜的细胞之一，承担着接受光并将光信号传递到视网膜内其他神经细胞的重要作用。 视细胞大致可分为锥体视细胞和杆体视细胞两种。 锥体视细胞用于明亮的地方，杆体视细胞用于黑暗的地方看东西的时候。 4 .视网膜变性疾病 这是一种严重的疾病，导致包括失明在内的强度视力障碍，在构成视网膜的细胞中，作为光受体的视细胞因年龄增加和遗传原因等而变性脱落。 代表性的有视网膜色素变性。 5 .单胞RNA分析 使用新一代可编程控制器，从质和量上全面调查各个细胞保持的整个mRNA的方法。 结合维度压缩等数学分析，可以根据基因表达状态进行细胞分类，可以鉴定传统组织学或细胞生物学方法无法知晓的新细胞种类和推测细胞状态。 6 .转录子 细胞中存在的所有转录产物(编码蛋白质的mRNA、不编码蛋白质的非编码RNA、微RNA等)的总体。 转录因子与基因组不同，无论是同一个体还是每个组织，甚至根据发生阶段、细胞外环境、刺激而变化。 7 .钙成像 一种测定细胞中钙离子流动，直接观察活动中细胞中钙离子浓度变化的方法。 在脑细胞的研究等中被广泛利用。 8 .光伤害模型 老鼠等动物模型，以及由视网膜建立的株化细胞，如果持续照射一定光量的光，就会发生细胞死亡。 在此基础上进行视网膜变性疾病病情调查和治疗药物探索的方法。 9 .有机化合物 试管中由干细胞制造的微型器官。 利用干细胞的自我复制能力和分化能力，通过自我组织形成三维的组织样结构。 研究支援