鉴定与药物代谢酶活性相关的拉曼光谱信号
不破坏细胞，只需光照即可成功可视化细胞内药物代谢酶( CYP )活性
为药品开发中的副作用评价和再生医疗等中使用的细胞产品的质量管理做出贡献
成功可视化肝细胞(肝实质细胞)内药物代谢酶( CYP )活性 诱导CYP表达的药物(利福平)添加量(0~4 µM )增加时肝细胞内CYP活性上升。 (※红色:细胞色素c、绿色: CYP活性)
药物代谢酶( CYP )主要在肝细胞和小肠上皮细胞中表达，并参与给药药物的代谢。 药物诱导和抑制CYP活性常常会引起意外的药物不良反应( ADR )，因此在药品开发中，有必要对含CYP活性的肝代谢进行评估。 由于仅靠计算机很难进行药物代谢的定量评估，因此同时进行了使用肝细胞和动物模型的药物应答试验。 另外，在被期待应用于再生医疗的肝细胞等细胞产品的质量管理中，作为肝脏重要功能的CYP活性的评价也是不可或缺的。 目前对CYP活性的评价依赖于使用荧光法、发光法等的端点测定和质谱法等破坏性的一次性方法，活性在细胞内的分布和经时变化的测定很困难，这妨碍了研究开发和产品开发。
产总研与大阪大学签订了《关于安装光子学分析的高度基础技术，测量各种生物分子的新一代生物传感系统相关研究开发的研究据点的设置和运用的备忘录》， 从2017年1月6日开始，在大阪大学吹田校区内设立了“产总研阪大学尖端光子学生物传感开放创新实验室”，以“同一屋檐下( under one roof )”的体制实施共同研究开发。 从2022年1月6日开始第二期计划，以“实现健康、无不安地享受人生的保健社会”为目标，推进创新的诊断机器、制药/再生医疗工具、健康监测技术的社会实证/实施研究。 本研究在开发目标之一的“无标识获取细胞/组织分子信息的技术开发及其在医疗器械中的应用”中，应用了大阪大学应用拉曼光谱技术开发的“可进行线扫描的高速拉曼显微镜”。 使用本显微镜，进行着微创且非破坏地将肝细胞的分子可视化，把握肝细胞的品质和状态的技术的开发。 在其努力中，我们发现在肝细胞中表达的药物代谢酶( CYP )的酶活性和氧化型CYP的分子数之间存在相关性。 利用这个发现，开发了通过拉曼散射检测细胞内的氧化型CYP酶群，测定CYP的酶活性的技术。 由于CYP在肝细胞中药物和毒物的代谢中起着重要的作用，并且可以通过拉曼散射同时检测CYP活性和其他生物分子，因此开发的技术可以从多角度分析药物的细胞应答。 另外，本研究开发由国立研究开发法人科学技术振兴机构的委托事业“研究成果展开事业共创的场地形成支援计划(共创领域育成型/正式型) ( 2020~2021年度/2022~2031年度) ( JPMJPF2009 )”和“战略创造研究推进事业CREST(2019~2024年度) ( JPMJCR1925 )”的支持下。
本研究的目标是，利用大阪大学开发的高速拉曼显微镜，分析肝细胞内分子所具有的拉曼光谱，开发能够测定肝细胞的分化度和成熟度以及基于此的细胞质量评价的技术。 在观察添加了诱导CYP的药剂的肝细胞时，发现可以通过拉曼散射检测出氧化型CYP酶群，并且其信号与CYP的酶活性相关。 图1a是添加了CYP酶群诱导剂利福平以“诱导”CYP表达的肝细胞( HepaRG )与未添加利福平的“对照(对照)”肝细胞的拉曼散射光谱比较的结果。 根据利福平诱导CYP表达的结果，可以确认表示氧化型CYP分子数的1370 cm-1和1636 cm-1的信号增加。 图1b是使用图1a的光谱，按频率构筑了细胞图像的拉曼散射像。 CYP(1370 cm-1和1636 cm-1 )对氧化型CYP的拉曼信号进行了成像。 在未添加利福平的对照肝细胞图像中，几乎观察不到显示氧化型CYP分子数的1370 cm-1和1636 cm-1的信号。 另一方面，添加利福平后，发现1370 cm-1和1636 cm-1的信号在细胞内增加。 图1c、d、e分别表示在CYP中表达最多的CYP3A4的免疫染色、CYP3A4活性、CYP3A4的免疫印迹的结果，可知这些结果与表示图1b的氧化型CYP分子数的1370 cm-1和1636 cm-1的拉曼信号相关。
图1 :添加利福平诱导肝细胞( HepaRG )中CYP表达
图中记载的“诱导”是添加利福平诱导CYP表达的细胞，“对照( Control )”是未添加利福平的细胞。 A .“诱导”肝细胞与“对照”肝细胞的拉曼光谱比较。 右上角的两张插图为1370 cm-1及1636 cm-1附近光谱的放大图。 b .“诱导”肝细胞与“对照”肝细胞的细胞内分子显像比较。 Cyt c(600 cm-1 )为细胞色素c，Cyt b5(675 cm-1 )为细胞色素b5，Phenyl.(1000 cm-1 )为苯丙氨酸，CYP(1370 cm-1和1636 cm-1 ) C .“诱导”的肝细胞与“对照”的肝细胞免疫染色像比较。 从左到右依次表示被蓝色荧光物质( DAPI )染色的细胞核( Nuclei )、被红色荧光物质( Alexa 594 )染色的细胞内的细胞色素b5(Cyt b5 )、被绿色荧光物质( Alexa 488 )染色的细胞内的CYP3A4 d .“诱导”的肝细胞与“对照”的肝细胞采用化学发光测定法的CYP3A4活性比较。 e .“诱导”肝细胞与“对照”肝细胞中蛋白质表达量的比较。 从肝细胞中获取细胞提取物，用免疫印迹定量CYP3A4、细胞色素c(Cyt c )、细胞色素b5(Cyt b5 )、β肌动蛋白(β-actin )的蛋白量。
仅凭上述结果，无法确定表示氧化型CYP分子数的1370 cm-1和1636 cm-1的拉曼信号是与CYP的总分子数相关还是与CYP活性相关，因此为了确认这一点，实施了以下实验。 作为基于机制的抑制剂( MBI )的氮杂萘以灭活含有CYP3A4的CYP3A酶群而闻名。 因为被灭活的CYP3A4分子停留在细胞内，所以期待CYP3A4的分子数不会发生变化。 图2a是针对添加或未添加茜素的肝细胞( HepaRG )，按频率构建细胞图像的拉曼散射图。 图中记载的CYP(1370 cm-1和1636 cm-1 )将氧化型CYP的拉曼信号成像。 可见，添加茜素降低了1370 cm-1和1636 cm-1的信号强度。 另一方面，为了测定CYP的分子数，进行免疫染色时，几乎没有确认占所有CYP大部分的CYP3A4的减少(图2b )。 该结果表明，表示氧化型CYP分子数的1370 cm-1和1636 cm-1的信号强度与CYP的总分子数无关，而与CYP的活性相关。
图2 :茜素添加对肝细胞( HepaRG )中CYP3A4的活性抑制
a .添加/不添加茜素肝细胞( HepaRG )的拉曼光谱比较。 Cyt c(600 cm-1 )为细胞色素c，Cyt b5(675 cm-1 )为细胞色素b5，CYP(1370 cm-1和1636 cm-1 )为氧化型CYP拉曼信号成像。 B .添加/不添加茜素肝细胞免疫染色情况的比较。 免疫染色红色荧光物质( Alexa 594 )染色的细胞内细胞色素b5和绿色荧光物质( Alexa 488 )染色的细胞内CYP3A4。 由于CYP在肝细胞中在药物和毒物代谢中起重要作用，与CYP活性相关的拉曼信号( 1636 cm-1 )和糖原( 940 cm-1 )、苯丙氨酸( 1000 cm-1 )、脂质( 1450 cm-1 ) 在细胞中，已知苯丙氨酸的信号与细胞的蛋白质质量相关。 将肝细胞( HepaRG )培养7天，促进肝细胞成熟，比较添加和不添加诱导CYP的利福平时，糖原的信号与CYP的信号呈逆相关。 该结果显示，CYP的活化和糖原分解引起的糖新生可能密切相关。
图3 :细胞内分子成像比较利福平( RIF )添加/不添加对培养7天的肝细胞( HepaRG )细胞的影响 D0是培养第0天，D7是培养第7天，D7 RIF是在第5天添加利福平诱导CYP的培养第7天的肝细胞。 在各自培养天数下，拍摄明视野像( Brightfield )、细胞色素b5(675 cm-1、Cyt b5 )、糖原( 940 cm-1、Glycogen )、氧化型CYP/CYP活性( 1636 cm-1，CYPs )、细胞色素c(600 cm-1，Cyt c )、苯丙氨酸( 1000 cm-1，Phenyl.)、脂质( 1450 cm-1，Lipids)这些结果表明，只要照射光就可以从无标记的细胞和组织中非破坏地取得生物分子信息，掌握细胞和组织的状态。 另外，由于可以测定每个细胞的代谢分子的量和CYP活性，所以与以往的方法不同，可以测定不均匀的细胞集团的每个细胞应答。 本技术可以应用于肝细胞的质量管理和制药开发中的肝代谢评价。 ※本新闻发布会的“概要图、图1、图2、图3”使用了引用原论文“图3、图1、图4、图5”进行修改后的内容。
今后，将利用本研究成果的肝脏分化和成熟状态的测定技术作为分析软件确立，以社会上实现利用拉曼光谱的肝细胞质量管理和制药开发用医疗支援机器为目标，致力于研究开发。 另外，拉曼光谱技术和拉曼显微镜技术通过照射光可以无标识且非破坏地取得细胞和组织内的生物分子信息，因此作为基于生物信息的疾病诊断、有无癌细胞的诊断、再生医疗等产品的质量管理等各种各样的医疗支援技术，被认为是有帮助的。 致力于以其他内脏器官和细胞为对象的疾病诊断和细胞质量管理技术的开发，以“实现健康、无不安地享受人生的保健社会”为目标。
刊登杂志: Communications Biology 论文标题: label-free chemical imaging of cytochrome P450 activity by Raman microscopy 作者: Menglu Li，Yasunori Nawa，Seiichi Ishida，Yasunari Kanda，Satoshi Fujita*，Katsumasa Fujita* DOI:10.1038/s42003-022-03713-1
药物代谢酶( CYP ) 几乎存在于细菌、植物、哺乳动物等所有生物中。 据报道，所有生物中有700种以上，人类中有50种左右的分子种类。 是在药物和毒物代谢中起重要作用的氧化酶。 也称为细胞色素P450(P450 )，因为在还原状态下在450 nm处显示最大吸收。
肝细胞(肝实质细胞) 是形成肝脏的细胞，是指承担肝脏实质功能(糖新生、代谢、解毒等)的细胞。 实际上，肝脏中除了肝细胞之外，还存在库柏细胞、星细胞、类洞内皮细胞等，因此如果单纯地称呼肝细胞的话，有可能会与其他肝脏的细胞混淆，为了明确地表达区别，有时也称为肝实质细胞。
利福平 抗生素的一种。 以CYP3A4为代表，通过诱导几种CYP的表达而闻名。
拉曼散射 向对象物质照射光时，散射的光中包含波长与照射光波长不同的散射光的现象。 拉曼散射中波长的变化起因于物质的分子振动，因此通过测量波长的变化可以得知对象物质的分子组成。
小肠上皮细胞 形成小肠上皮的细胞。 上皮细胞是指覆盖身体、体腔等表面，形成将外侧和内侧隔开的屏障的细胞。
药物不良反应( ADR ) 是指与药物的主要作用无关的药理反应(副作用)中不良反应。
端点测量 在对象样品中添加反应试剂等，经过一定的反应时间后，样品的荧光发光吸收等测定方法。 端点测量会破坏细胞等样品进行测量，因此无法进行细胞内的反应分布和经时测量。
线扫描 将激光加工成线状，用“线”扫描对象物的方法。 开发的拉曼显微镜通过以“线”为单位而不是“点”为单位进行扫描来实现高速化。
HepaRG 是法国国立卫生医学研究所建立的人源性肝细胞株，具有人类肝细胞特异性功能。 已知CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4的表达量与人原代肝细胞水平相同，作为人原代肝细胞的替代广泛应用于药代动力学、毒性试验、药理试验等。
CYP3A4 是属于CYP酶群的酶，占人类肝脏中存在的CYP的大部分。 已知通过利福平诱导表达。
免疫染色 使用与作为样品中所含目标(抗原)的蛋白质特异性结合的抗体使目标可视化的方法。 通过在抗体一侧预先附加荧光物质等，可以使目标的分布可视化。
免疫印迹 将电泳分离的蛋白质转印到膜(膜)上后，利用抗体等只检测目标蛋白质的方法。
基于机制的抑制剂( MBI ) 不可逆地阻碍酶活性的物质。 抑制剂与活性部位结合，在那里被酶修饰生成反应性基团，不可逆地反应形成稳定的抑制剂-酶复合体。
阿扎姆林 抗生素的一种。 已知为CYP3A4的基于机制的抑制剂( MBI )。
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