－简便且高精度地分析微生物的基因组DNA－
理化学研究所(理研)光量子工程研究中心尖端光学元件开发团队的山形丰团队组长、青木弘良研究员、生物资源研究中心微生物材料开发室的大熊盛也室长、雪真弘开发研究员(研究当时)等共同研究小组开发了用于微生物的1细胞基因组分析[1]的微胶囊。本研究成果有望为以微生物为对象的环境科学、生物技术以及医疗领域等做出贡献。 地球上存在各种各样的微生物，形成了复杂多样的生态系统。 但大多数微生物很难培养，其功能尚不清楚。 此次联合研究小组为了微生物1细胞的基因组DNA[2]分析( 1细胞基因组分析)，开发了微细的“琼脂糖凝胶微胶囊( AGM )”。 AGM的内部为液状，外侧被琼脂糖[3] (琼脂)覆盖，可以廉价且简单地制作。 在AGM内包埋1个微生物细胞，通过在皮升( pL，1pL为1兆分之一升)尺度的微小空间中的酶反应，能够比以往更均匀地扩增DNA，获得高质量的基因组信息。 本研究刊登在《在线科学杂志》( 10月18日)上。
1细胞基因组分析微胶囊的显微镜像(绿点为大肠杆菌)
背景 地球上存在各种各样的微生物，在环境、工业、医疗等方面起着重要的作用。 但大多数微生物无法培养，其生态和功能都笼罩在面纱之下。 因此，近年来，通过不培养微生物群体，而是精制环境中的基因组DNA来分析微生物群体功能的“元基因组分析[4]”，各种各样的微生物的身影逐渐变得清晰起来。 另一方面，相对于以集团为对象的元基因组分析，以1个微生物细胞为对象的“1细胞基因组分析”可以得到更高精度的基因组信息。 但是，如果将微量的基因组DNA放大到分析所需的量，则会被不均匀地放大(放大偏压[5] )，存在难以得到整体的基因组信息的问题。 反应量的微量化对抑制放大偏压有效，但需要专用装置[6]。 因此，在环境微生物的1细胞基因组分析中，需要能够简便制作的微量反应胶囊。
研究方法和成果 联合研究小组为了实现1细胞基因组DNA的简便均匀的扩增，开发了内部为液状、外层覆盖有琼脂糖凝胶的“琼脂糖凝胶微胶囊( AGM )”。
图1琼脂糖凝胶微胶囊( AGM ) A AGM的示意图。 用琼脂糖凝胶覆盖含有分析对象微生物的液状芯。 B AGM的显微镜像。 绿是大肠杆菌。
AGM制作如下。 首先，将微生物和海藻酸[7]的混合物分散在油中进行凝胶化，制作中心核心。 将该芯与加热溶解的琼脂糖混合后，再次分散在油中，冷却，使琼脂糖凝胶化。 将其洗涤后，溶解芯，制成微量反应胶囊(图2 )。 使用廉价的试剂和市售的实验器具，一次操作就可以制作数十万个AGM。
图2 AGM制作步骤
首先，将大肠杆菌、海藻酸及碳酸钙( CaCO3)的混合物悬浮分散在50mL塑料管内的油1 (异硬脂醇)中。 接下来用乙酸溶解CaCO3，就形成了Ca2+和海藻酸结合的海藻酸凝胶芯。 将与该芯加热溶解的琼脂糖混合后，分散在油2 (聚甘油-6八聚甘油酯)中进行冷却，在芯的外侧形成琼脂糖凝胶。 最后，用EDTA (乙二胺四乙酸)溶解海藻酸凝胶后，洗涤，制备AGM。 实际上，我们用AGM进行了1细胞基因组分析。 评估用试样使用了大肠杆菌、人肠道细菌混合物(模型样品)、白蚁肠道细菌。 白蚁在肠道内共生着无数的微生物，合作高效地分解植物生物量。 白蚁肠道细菌具有高纤维素酶[8] (纤维素分解酶)活性，在产业上也备受关注。 将各微生物试样包埋在AGM中后，以相当于以前方法约百万分之一的量的皮升( pL，1pL为1兆分之一升)比例，用一种叫Phi29 DNA聚合酶的酶扩增基因组DNA。 分离扩增了基因组DNA的AGM (图3A )后，使用新一代DNA序列发生器[2]分析碱基序列，评价基因组DNA的均匀性。 结果表明，在所有试样中，使用AGM扩增基因组DNA时，与以往方法相比，基因组DNA的复盖率更高，可以获得均匀的基因组DNA (图3B )。 从而解决了以往的难题，建立了简便、高精度的微生物单细胞基因组DNA分析法。
图3基于agm的1细胞基因组分析 在AAGM内扩增的基因组DNA。 绿色显示了被放大的DNA。 用BAGM和传统方法比较了扩增后基因组DNA的均一性。 AGM比传统方法的DNA复盖率更高，获得了更均匀的基因组DNA。 **: P<0.01
今后的期待 通过本研究，微生物的1细胞基因组分析变得容易，因此可以期待对至今为止难以分析的微生物获得新的见解。 例如，使用AGM高精度地分析白蚁的肠内细菌的基因组，可以进行用以往的元基因组分析难以捕获的微生物的分析和微生物间复杂的相互作用的阐明。 另外，人的肠道内也存在各种各样的微生物，通过肠道菌群的平衡来维持我们的健康。 我们认为，对其进行1细胞基因组分析，有助于阐明疾病与肠道菌群的关系，通过激活肠道细菌促进健康，确立大肠癌的新预防医疗等，解决与我们的健康和医疗相关的各种问题。 本方法中使用的试剂也有望作为试剂盒商品化。 今后，我们将面向高通量分析，开发AGM自动制作装置和分离装置，以实现本方法的普及和高度化。
补充说明 1细胞基因组分析 使用微细玻璃管或荧光细胞分选器等专用机器分离微生物，分析基因组DNA的方法。 虽然与元基因组分析相比工序多，但是具有获得的遗传信息来源于1个微生物细胞等元基因组分析所没有的优点。 2 .基因组DNA，新一代DNA序列发生器 基因组DNA是构成生物设计图的遗传物质。 遗传信息由ACGT的四个碱基组合(序列)形成。 根据基因组DNA上的碱基序列，鉴定负责生物功能的蛋白质的设计图即基因序列，根据基因的功能推测生物的功能。 微生物的基因组DNA有数百万个碱基，以前很难分析碱基序列，但近年来由于新一代DNA序列发生器的发展，几天内就可以读取。 因此，如何均匀扩增巨大的基因组DNA是一个课题。 3 .琼脂糖 将海藻中得到的琼脂进一步精制，提高了品质。 透明性高，用于各种生物实验。 加热时溶解，冷却时凝胶化。 4 .元基因组分析 不培养微生物群体，直接从环境试样中提取微生物基因组DNA，全面分析碱基序列的方法。 根据彼此的相似性将得到的碱基序列分类组合，重构基因组DNA上的碱基序列。 5 .放大偏置 1由于细胞的基因组DNA非常微量，使用酶复制扩增至分析所需的量。 此时，虽然使用了具有高扩增效率的酶，但是局部的基因组DNA会呈指数函数扩增，结果存在难以得到没有增加的地方的遗传信息的问题。 反应量微量化可以抑制过度的基因组DNA扩增，防止扩增偏置扩大。 6 .专用装置 作为微反应量反应室，使用由半导体制造技术( MEMS技术)制作的微细阱和微流路、以及由微流路制作的微小液滴。 市面上销售的装置很少，大多数情况下需要用自家的MEMS设备制作。 7 .海藻酸 从海藻中得到的多糖类。 通过钙离子凝胶化，相反通过与钙离子结合的EDTA (乙二胺四乙酸)液状化。 8 .纤维素酶 分解植物纤维纤维素的酶。 用于洗涤剂等，在工业上有用。
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